Mitochondriale fusie werd gemeten door het bijhouden van de gelijkschakeling van de photoconverted matrix-gerichte GFP over het mitochondriale netwerk in de tijd. Tot dusver kon slechts een cel worden onderworpen aan een uur lang kinetische analyse tegelijk. Wij presenteren een methode die meet gelijktijdig meerdere cellen, waardoor versnelling van het proces van gegevensverzameling.
Methodenartikel
Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriale fusie speelt een essentiële rol in de mitochondriale calciumhomeostase, bioenergetica, autofagie en kwaliteitscontrole. Fusie wordt in levende cellen gekwantificeerd door fotoconversie van matrix-gerichte foto-activeerbare GFP (mtPAGFP) in een subset van mitochondriën. De snelheid waarmee de gefotoconverteerde moleculen over de gehele mitochondriale populatie equilibreren, wordt gebruikt als maat voor de fusieactiviteit. Tot nu toe werden metingen uitgevoerd met een time-lapsebenadering voor één enkele cel, waarbij de equilibratie in één cel over een uur werd gekwantificeerd. Hier schalen we een eerder gepubliceerde methode voor levende cellen op en automatiseren we deze, gebaseerd op het gebruik van mtPAGFP en een lage concentratie TMRE (15 nm). Deze methode behelst het foto-activeren van een klein deel van het mitochondriale netwerk, het verzamelen van hoge-resolutie stacks van confocale secties elke 15 min gedurende 1 uur, en het kwantificeren van de verandering in signaalintensiteit. Afhankelijk van verschillende factoren, zoals het gemak van het vinden van PAGFP-expresserende cellen en het signaal van de foto-geactiveerde regio's, is het mogelijk om ongeveer 10 cellen binnen de intervallen van 15 min te verzamelen. Dit zorgt voor een aanzienlijke verbetering van de tijdefficiëntie van deze assay, terwijl de hoge-resolutie subcellulaire kwantificatie en de kinetische parameters die nodig zijn om de details van het mitochondriale gedrag in zijn natuurlijke cytoarchitecturale omgeving vast te leggen, behouden blijven.
Mitochondriale dynamiek speelt een rol bij vele cellulaire processen, waaronder respiratie, calciumregulatie en apoptose1,2,3,13. De structuur van het mitochondriale netwerk beïnvloedt de functie van de mitochondriën en de manier waarop ze interageren met de rest van de cel. Door voortdurende deling en fusie nemen mitochondriale netwerken diverse vormen aan, variërend van sterk gefuseerde netwerken tot meer gefragmenteerde netwerken. Interessant is dat de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, Charcot-Marie-Tooth 2A en dominante optische atrofie zijn gecorreleerd met een veranderde mitochondriale morfologie, namelijk gefragmenteerde netwerken4,10,13. Vaar raakten mitochondriën na fragmentatie gedepolariseerd, en bij accumulatie leidt dit tot een verslechterde celfunctie18. Het is aangetoond dat mitochondriale fissie een signaal aan de cel geeft om voort te gaan naar apoptose. Het kan ook een mechanisme bieden waarmee gedepolariseerde en inactieve mitochondriën worden gescheiden om het grootste deel van het netwerk robuust te houden14. Fusie van mitochondriën leidt daarentegen tot het delen van matrixeiwitten, opgeloste stoffen, mtDNA en de elektrochemische gradiënt, en lijkt bovendien progressie naar apoptose te voorkomen9. Hoe fissie en fusie van mitochondriën de cellulaire homeostase en uiteindelijk het functioneren van het organisme beïnvloeden, moet verder worden onderzocht, waardoor de continue ontwikkeling en optimalisatie van methoden om informatie over deze fenomenen te verzamelen noodzakelijk is.
Bestaande assays voor mitochondriële fusie hebben diverse inzichten in de mitochondriële fysiologie opgeleverd, waarbij elke methode eigen voordelen heeft. De hybride PEG-fusieassay7 mengt twee populaties van verschillend gelabelde cellen (mtRFP en mtYFP) en analyseert de mate van menging en colocalisatie van fluoroforen in gefuseerde, meerkernige cellen. Hoewel deze methode waardevolle informatie heeft opgeleverd, kunnen niet alle celtypen fuseren, en de omstandigheden waaronder fusie wordt gestimuleerd vereisen het gebruik van toxische geneesmiddelen die waarschijnlijk het normale fusieproces beïnvloeden. Recentelijk is er een celvrije techniek ontwikkeld waarbij geïsoleerde mitochondriën worden gebruikt om fusiegebeurtenissen waar te nemen op basis van een luciferase-assay1,5. Twee humane cellijnen worden getarget met respectievelijk het amino- of het carboxy-terminale deel van Renilla-luciferase, samen met een leucine zipper om dimerisatie bij menging te garanderen. Mitochondriën worden uit elke cellijn geïsoleerd en gefuseerd. De fusiereactie kan zonder cytosol plaatsvinden onder fysiologische omstandigheden in aanwezigheid van energie, een geschikte temperatuur en een membraanpotentiaal van het binnenste mitochondriële membraan. Interessant is dat werd vastgesteld dat het cytosol de mate van fusie moduleert, wat aantoont dat cel-signalering het fusieproces reguleert 4,5. Deze assay zal zeer nuttig zijn voor high-throughput screening om componenten van het fusieapparaat en farmacologische verbindingen die de mitochondriële dynamiek kunnen beïnvloeden, te identificeren. Er zullen echter meer gedetailleerde mitochondriële assays op hele cellen nodig zijn om deze in vitro assay aan te vullen en deze gebeurtenissen binnen een cellulaire omgeving waar te nemen.
Een techniek voor het monitoren van mitochondriale dynamiek in hele cellen wordt al enige tijd gebruikt en is gebaseerd op een mitochondriaal gericht fotoactiveerbaar GFP (mtPAGFP)6,11. Na expressie van het mtPAGFP wordt een klein deel van het mitochondriale netwerk fotogeactiveerd (10-20%), en de verspreiding van het signaal naar de rest van het mitochondriale netwerk wordt elke 15 minuten gedurende 1 uur geregistreerd met time-lapse confocale beeldvorming. Elk fusie-event leidt tot een verdunning van de signaalintensiteit, waardoor de fusiesnelheid gekwantificeerd kan worden. Hoewel fusie en fissie continu in cellen plaatsvinden, monitort deze techniek alleen fusie, aangezien fissie niet leidt tot een verdunning van het PAGFP-signaal6. Co-labeling met lage concentraties TMRE (7-15 nM in INS1-cellen) maakt kwantificering van het membraanpotentiaal van mitochondriën mogelijk. Wanneer mitochondriën hypergepolariseerd zijn, nemen ze meer TMRE op, en wanneer ze depolariseren, verliezen ze de TMRE-kleurstof. Mitochondriën die depolariseren hebben geen voldoende membraanpotentiaal meer en neigen er niet toe om efficiënt, indien überhaupt, te fuseren. Daarom kunnen actief fuserende mitochondriën worden gevolgd met deze lage concentraties TMRE9,15. Accumulatie van gedepolariseerde mitochondriën die geen TMRE-signaal vertonen, kan een teken zijn van fototoxiciteit of celdood. Hogere concentraties TMRE maken mitochondriën zeer gevoelig voor laserlicht, en daarom moet er grote zorg worden betracht om overlabeling met TMRE te vermijden. Als het effect van depolarisatie van mitochondriën het onderwerp van belang is, kan een techniek met iets hogere concentraties TMRE en intenser laserlicht worden gebruikt om mitochondriën op een gecontroleerde manier te depolariseren (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). Om er zeker van te zijn dat toxiciteit door TMRE geen probleem is, raden we aan om gelabelde cellen (3-15 nM TMRE) bloot te stellen aan de beeldvormingsparameters die in de assay zullen worden gebruikt (bijvoorbeeld 7 stacks van 6 optische secties achter elkaar) en de celgezondheid na 2 uur te beoordelen. Als de mitochondriën te gefragmenteerd lijken en de cellen afsterven, kunnen andere mitochondriale markers, zoals dsRED of Mitotracker red, in plaats van TMRE worden gebruikt.
De mtPAGFP-methode heeft details onthuld over het gedrag van het mitochondriële netwerk die met andere methoden niet konden worden gevisualiseerd. We weten nu bijvoorbeeld dat mitochondriële fusie volledig of transiënt kan zijn, waarbij de matrixinhoud kan mengen zonder dat de algemene morfologie van het netwerk verandert. Daarnaast weten we dat de kans op fusie onafhankelijk is van de contactduur en de dimensie van het organel, en wordt beïnvloed door de beweeglijkheid van het organel, het membraanpotentiaal en de geschiedenis van eerdere fusieactiviteit8,15,16,17.
In dit manuscript beschrijven we een methodologie voor het opschalen van het eerder gepubliceerde protocol met mtPAGFP en 15nM TMRE8, om meerdere cellen tegelijkertijd te kunnen onderzoeken en de tijdsefficiëntie van de gegevensverzameling te verbeteren zonder in te boeten op de subcellulaire resolutie. Dit is mogelijk gemaakt door het gebruik van een geautomatiseerde microscooptafel en programmeerbare software voor beeldacquisitie. Zen-software van Zeiss stelt de gebruiker in staat om verschillende aangewezen cellen die mtPAGFP tot expressie brengen, te markeren en te volgen. Elke van deze cellen kan worden gefotoactiveerd in een specifiek interessegebied, waarna stacks van confocale coupes kunnen worden gemonitord voor het mtPAGFP-signaal en TMRE op gespecificeerde intervallen. Andere confocale systemen kunnen worden gebruikt om dit protocol uit te voeren, mits er een programmeerbare geautomatiseerde tafel is, een incubator met CO2 en een middel om de PAGFP te fotoactiveren; óf een multifotonlaser, óf een 405 nm diodelaser.
Protocol
1. Image Plate Voorbereiding
- Culture INS1 cellen in RPMI medium met 10% foetaal runderserum standaard, 1% penicilline streptomycine, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM pyrodruivenzuur, en 11 mM glucose 80% confluentie.
- Trypsinize de INS1 celculturen met 0,05% trypsine en plaat ze op poly-D-lysine gecoat dekglaasje bodem beeldvorming platen (30-40% confluentie).
- Laat voor platen 60-80% confluentie (~ 2 dagen) bereikt en voeg mitochondriale matrix gericht (COXVIII) adenovirale PA-GFP gedurende 24 uur (moi = 5). Exchange media en laat cellen om te groeien gedurende de volgende 2 dagen voor de beeldvorming.
- Op de dag van beeldvorming, voeg 7-15 nM TMRE aan de beeldvorming platen, en evenwicht voor ten minste 45 minuten.
- Gedurende deze tijd weer op incubator (fase boven incubator is hier gebruikt) en laat de microscoop tot 37 equilibreren ° C gedurende ongeveer 1 uur. Zet de 5% CO 2.
2. Imaging Parameters voor de Zeiss LSM 710 confocale microscoop
- Na de microscoop heeft in evenwicht gebracht, onder de Overname tab, klik op "toon handgereedschap", opent u de beeldvorming ingesteld panel, en kies "channel mode" en schakel te volgen om de "frame".
- In het licht pad panel, kies LSM en channel mode. Werken vanuit het monster icoon naar boven, selecteer "achter", MBS 690 +, en MBS 488. Aan de onderkant van het paneel, kies "T-PMT" om visualisatie van de heldere veld of DIC kanaal mogelijk te maken.
- Eindig het instellen van de parameters lichtpad door het instellen van het bereik voor de GFP kleurstof 490-540 nm en 580-700 nm voor de TMRE kleurstof.
- In de overname-modus, gebruik dan een 512 × 512 pixels scan veld, gemiddeld 4x, en kies een zoomfactor (die kunt u een consistente te houden voor calibratie doeleinden).
3. Het optimaliseren van de Imaging Parameters
- Met behulp van het plan apochromat 100x (1,4 NA) objectief, focons aan de cellen met de halogeen licht, niet fluorescerend licht, de mitochondriën te beschermen tegen fototoxiciteit.
- Scherm voor PA-GFP tot expressie brengen met behulp van een maximaal geopende gaatje en scannen naar de cellen die zijn lichter groen te vinden.
- De laagste energie van de laser 2 foton nodig PA-GFP geactiveerd en de afbeeldingsparameters zodat het signaal niet de detector verzadigen optimaliseren. Controleer of de PA-GFP signaal colocalizes met de TMRE signaal voor een paar z-serie. Het verlies van de TMRE signaal geeft mitochondriale depolarisatie of fototoxiciteit, en cellen vertonen deze kenmerken mag niet worden gebruikt voor analyse.
- Zoek een PA-GFP expressie brengende cel en geef een zoomfactor.
- Stel de Z-serie bereik tot 6 sneetjes (dit bereik zal moeten alle 10 cellen te voldoen, tenzij er een specifieke z-focus is vastgesteld op elke positie) te verzamelen.
- Sla de beeldvormende methode voor elke cel (cel 1, cel 2, enz.).
4. Pas het automatiserend deel van het programma en wijzen zij de 10 cellen volg je voor de 1 uur Mitochondriale Fusion Assay
- Op het linker paneel van de multitime venster, selecteer dan de "besparing" paneel, en geef de locatie waar de bestanden worden opgeslagen.
- In de "Overname" paneel, laadt de overname methode opgeslagen voor cel 1 in de scan configuratie en controleer de z-stack doos. Kies ook "gemarkeerd Z-midden van z stack".
- In de "blokken" paneel, selecteert u 'enkel blok op elke locatie ". Op "add blokken" voor elk interval te bepalen.
- In de "timing" paneel, selecteer "wacht interval" en type "0" in de "wacht-interval voor de blok op eerste locatie alleen". Blokken 2-4 zal hebben "15 min" in deze sectie.
- In de locatie paneel, kies "De focus verplaatsen naar positie te laden tussen locaties" en "load config te scannen wanneer 'naar loc' of 'volgende loc' geklikt. Onder de" edit locaties list "kies" Alles wissen "en selecteer" multiple locaties gemotoriseerde stadium ".
- UndER de "Bleach" paneel, klik op de "bleekwater" box, en wijzen de configuratie bestand in het "config" pull down menu, zoals aangewezen in het venster van de belangrijkste software. Daarna, in de "bleken" venster, slaat u het juiste fotoactivatie methode. In de regio's panel, kies de ROI voor deze specifieke cel, en voeg deze ROI aan de multitime door te kiezen voor "add huidige regio om de ROI lijst" venster. Zorg ervoor dat u op dezelfde locatie te selecteren in de "ROI" naar beneden te trekken menu.
Voor de timing goed te laten werken en voor elke cel een interval van 15 minuten te hebben, twee methoden moeten worden opgeslagen. In de lijst met blokken, zal de eerste zijn de "echte" fotoactivatie configuratie, en de rest zal een "mock" configuratie die geen gebruik maakt van de twee-foton laser hebben. Het eerste blok zal ook enige blok die geen vertraging (BKIntv = 0). Derhalve is de werkwijze begint met een basislijn scan, gevolgd door een fotoactivatie scan. De rest van de blokken 900 sec BkIntv enop elk tijdstip er twee scans zoals op tijdstip 0 sec, de timing consistentie.
- Voor elk van de 10 cellen gevolgd na verloop van tijd uitvoeren deze volgorde:
Zoek een PAGFP uiten cel op te slaan zijn imaging methode
Plaats het podium positie paneel te markeren, geeft u imaging methode
Belangrijkste ROI panel-kies een regio van belang is voor gefotoactiveerd Bleach zijn panel-save specifieke ROI en ook in de ROI doos te laden:
Wis de ROI en zet de scan zoom tot en met 1
Zoek de volgende cel en zet de zoom
Herhaal dit proces voor de volgende 9 cellen
Controleer of elke fase locatie en alle blokken de juiste beeldvormende methode (scan configuratie) verbonden zijn. Zorg er ook voor dat het eerste blok op elke locatie komt overeen met de juiste fotoactivatie methode, terwijl de rest bevat een "mock" methode. Tot slot, selecteer "run".
5. Analyseer de PA-GFP intensiteit van het signaal
- Voor de cellen waarin de fotoactiveerbare-GFP signaal colocalizes met de rode TMRE signaal af te trekken van de achtergrond in de PAGFP beelden (hier gebruiken we Metamorph).
- Toen de gegevens exporteren naar Excel en bereken het gemiddelde intensiteit voor z-stacks op elk tijdstip. Gooi optische secties die geen signaal te hebben.
- Meet het signaal verdunning in elke z-stack door het percentage van het oorspronkelijke gefotoactiveerd signaal.
Elk gegeven wordt afgetast en geregistreerd tweemaal resulteert in tweevoud z-stack informatie voor elk tijdstip. Controleer of de z-stack waarden mee eens. Zo niet, dat indicatief is voor een probleem (bijv. gericht, celverplaatsing).
6. Representatieve resultaten
Bij een fusie voordoet tussen een geactiveerde en niet geactiveerd PA-GFP mitochondrion de PAGFP in de mitochondriale matrix mengt met de niet-gemerkte matrix en wordt verdund over een groter gebied, waardoor het signaalintensiteit (figuur 1a). In de INS1 cel, een significante daling van de intensiteit van het signaal gebeurt elke 15 minuten, totdat een evenwichtstoestand van de mitochondriale fusie is bereikt (ongeveer 1 uur). Merk op dat de cel in figuur 1B bijna volledige colokalisatie van PA-GFP en TMRE signalen vertoont. In deze testen een zeer lage concentratie van TMRE (15 nM) wordt gebruikt om de richten fotoactivering van PAGFP, en de cel gezondheidstoestand. Cellen met een overvloed aan gedepolariseerd mitochondriën zal hebben onvolledige colokalisatie van PAGFP en TMRE en mag niet worden geanalyseerd omdat dit duidt op fototoxiciteit, of cellen in een stervende staat.
De equilibratietijd voor mitochondriële fusie is meestal 1 uur in INS1 cellen, wanneer ~ 15% van de mitochondriale volume geactiveerd. Soms, zelfs wanneer een klein gedeelte wordt belicht meeste mitochondria worden gefotoactiveerd door te sterk netwerk, in welk geval verdere fusie is moeilijk op te sporen. Andere soorten cellen kunnen vertonen verschillende tijden en evenwicht moeten worden getest met kortere tussenpozen en over een langere periode aan mitochondriaal dynamiek te karakteriseren. Om mitochondriale fusie tegen te gaan, kunnen cellen worden geplaatst binnen een lipotoxic omgeving. Eerder is aangetoond dat 0,4 mM palmitaat fragmenten mitochondriën, en remt de mitochondriale fusie 9. Dit effect is te zien in figuur 2, waarin mitochondria gefragmenteerd, maar de signaalsterkte van het mtPAGFP niet zoveel veranderen onder normale omstandigheden (figuur 1). Daarom is de verdunning van het PA-GFP signaal waarschijnlijk vanwege mitochondriale fusie dan splijting. In andere cellen typen raden met andere bekende methoden om mitochondriaal fragmentatie induceren, zoals silencing OPA1 die nodig is voor mitochondriale fusie 14.
Figuur 1. Typische verdunning van de PA-GFP verkregen na fotoactivatie tijdens een mitochondriaal fusie assay. A. PA-GFP wordt minder helder door mitochondriale fusie gebeurtenissen die tot de verdunning van het eiwit in toenemende gebied te zien is in deze geprojecteerde beelden van 6 optische secties gekwantificeerd om de 15 minuten. B. TMRE met PA-GFP blijkt dat de mitochondriën actief zijn en niet gedepolariseerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Mitochondriale fusie geremd met 0,4 mM palmitaat vermindert de verwatering van de PA-GFP. A. Projecties van 6 optische secties met korte mitochondriën met een onveranderlijke signaal intensiteit in de tijd. B. colokalisatie van PA-GFP met TMRE laat zien dat de mitochondriën niet degepolariseerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Discussie
Deze methode maakt het afbeelden van ongeveer 10 cellen per keer zo verkrijging wordt elke 15 minuten na fotoactivatie. Het exacte aantal cellen is afhankelijk van hoe snel men in staat is te vinden en markeer de mtPAGFP tot expressie brengen binnen de cultuur schotel, en hoe snel kan men stellen alle software parameters. Om de automatisering soepel verloopt een gelijkmatige laag van cellen moet worden gebruikt, omdat de aangewezen z-stack marges zal gelden voor alle cellen.
De omvang van deze eerste fotoactivatie gebied zal van toepassing op de equilibratietijd. Om mitochondriale fusie meten, is het belangrijk om photoactivate slechts 10-20% van het netwerk, zodanig dat de verspreiding van het signaal aan de rest van het netwerk kan worden gecontroleerd tijd. Indien teveel van het netwerk gefotoactiveerd, is het mogelijk dat volledige versmelting optreedt te snel, en de gebeurtenis niet wordt opgenomen.
Men moet uiterst voorzichtig worden genomen omaanpassen laservermogen van twee foton laser en de TMRE concentratie fototoxiciteit waardoor mitochondriale depolarisatie voorkomen. Ervoor zorgen dat de mtPAGFP signaal colocalizes met de TMRE signaal kan helpen bij de beoordeling van fototoxiciteit en algemene gezondheid van de cellen 8,15. Verlichting met epifluoerescent licht dient te worden vermeden. Tijdens het zoeken naar cellen die mtPAGFP, moet de pinhole zijn maximaal geopend tijdens het scannen met een laag vermogen 488nm excitatie. Aanpassen van twee foton laservermogen om photoactivate voldoende PA-GFP het signaal meten gedurende 1 uur maar niet oversaturate een van de cellen kan lastig zijn 8. Maar de tijd moet worden besteed in deze optimalisatie stap, want zodra automatische programma wordt gestart, is het vervelend om het te stoppen, om meer cellen te kiezen en te hervatten.
Voor de kwaliteitscontrole, de verwerving van een differentieel interferentie contrast (DIC) beeld (of doorgelaten licht) om de scherpstelling te controleren op de cellen kunnen zeerbehulpzaam en een goede manier om luchtbellen in de immersie olie tijdens het scannen te detecteren; dat komt uit de bewegingen van het podium.
Hoewel met deze methode mtPAGFP verzamelt gegevens over de unidirectionele beweging van mitochondriale matrixeiwitten van gefotoactiveerd mitochondria die niet gelabeld is het denkbaar om gebruik te maken van deze techniek om andere te bestuderen. Zo kunnen bepaalde fluorochromen worden bevestigd aan membraaneiwitten hun specifieke beweging houden tijdens fusie gebeurtenissen zoals aangetoond voor ABC-me, de combinatie van die optreedt op een ander tijdstip schaal van het mengen van oplosbare matrixeiwitten 15.
Openbaarmakingen
Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Zeiss, Inc
Dankbetuigingen
Wij danken de Tufts Center for Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), de mitochondriën Affiniteit Research Collaborative (mtARC), ondersteund door de Evans Centrum voor Interdisciplinair Biomedisch Onderzoek aan de Boston University Medical Campus, Link Medicine Corporation, en Zeiss voor de ondersteuning van dit werk.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| COXIII-adenoviraal PA-GFP | Dr Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocale | Zeiss |
Referenties
- Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
- Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
- Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
- Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
- Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
- Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
- Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
- Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
- Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
- Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100(2011).
- Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
- Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
- Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
- Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
- Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
- Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).
Herprints en machtigingen
