Oprichting van Microbiële Eukaryote Enrichment Culturen van een chemisch Stratified Antarctic Lake en Beoordeling van Carbon Fixatie Potentiële

Samenvatting

Microbiële eukaryoten zijn zowel een bron van fotosynthetisch afgeleide koolstof en top roofzuchtige soort in permanent met ijs bedekte Antarctische meren. Dit rapport beschrijft een verrijking cultuur benadering van het metabool veelzijdige microbiële eukaryoten isoleren van de Antarctische meer, Lake Bonney, en beoordeelt anorganische koolstof fixatie mogelijkheden met behulp van een radio-isotoop test voor ribulose-1 ,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RuBisCO) activiteit.

Samenvatting

Lake Bonney is een van de vele permanent met ijs bedekte meren gelegen in het McMurdo droge valleien op Antarctica. De eeuwige ijslaag zorgt voor een chemisch gelaagde waterkolom en in tegenstelling tot andere binnenlandse wateren, grotendeels voorkomt externe input van koolstof en voedingsstoffen uit stromen. Biota worden blootgesteld aan tal van milieu-invloeden, waaronder het hele jaar door ernstige gebrek aan voedingsstoffen, lage temperaturen, extreme schaduw, hypersalinity, en 24-uurs duisternis in de winter ^1. Deze extreme omstandigheden beperken de fauna en flora in Lake Bonney bijna uitsluitend voor micro-organismen ^2.

Eencellige micro-organismen eukaryoten (de zogenaamde "protisten") zijn belangrijke spelers in de wereldwijde biochemische cycli ³ en spelen een belangrijke ecologische rol in de cyclus van koolstof in de droge vallei meren, waarmee het zowel de primaire en tertiaire rollen in het aquatisch voedselweb. In de droge vallei in het water levende voedselweb, protisten dat ik dat oplossennorganic koolstof (autotrophy) zijn de belangrijkste producenten van organische koolstof voor organotrofe organismen ^{4, 2.} Phagotrophic of heterotrofe protisten staat inname van bacteriën en kleinere protisten optreden als toppredatoren in de voedselketen ^5. Last, een onbekend deel van de protisten bevolking in staat is om gecombineerde mixotrophic metabolisme ^{6, 7.} Mixotrophy in protisten betreft het vermogen om fotosynthetische capaciteit combineren met phagotrophic inname van prooi micro-organismen. Deze vorm van mixotrophy verschilt van mixotrophic metabolisme in soorten bacteriën, die over het algemeen gaat de opname opgeloste koolstof moleculen. Er zijn op dit moment zeer weinig protisten isolaten van permanent ijs bedekte polaire meren, en studies van de protisten diversiteit en ecologie in deze extreme omgeving zijn beperkt ^{8, 4, 9, 10, 5.} Een beter begrip van protisten metabolische veelzijdigheid in het eenvoudige droge vallei meer voedselweb zal helpen bij de ontwikkeling van modellen voor de role van protisten in de mondiale koolstofcyclus.

We gebruikten een verrijking cultuur benadering van potentieel fototrofe en mixotrophic protisten isoleren van Lake Bonney. Sampling diepten in de waterkolom werden gekozen op basis van de locatie van de primaire productie maxima en protisten fylogenetische diversiteit ^{4, 11,} en ​​variabiliteit in de grote abiotische factoren die van invloed protisten trofische modi: ondiepe bemonstering diepten zijn beperkt voor belangrijke voedingsstoffen, terwijl de diepere bemonstering diepten beperkt door de beschikbaarheid van licht. Bovendien zijn meer watermonsters aangevuld met verschillende soorten kweekmedia om de groei van verschillende fototrofe organismen.

RuBisCO katalyseert de snelheidsbepalende stap in de Calvin Benson Bassham (CBB) cyclus, de belangrijkste route door die autotrofe organismen vast anorganische koolstof en zorgen voor organische koolstof voor hogere trofische niveaus in aquatische en terrestrische voedselwebben ^12. In deze studie we toegepast een radio-isotoop test aangepast voor gefilterde monsters ¹³ tot en met maximale carboxylase-activiteit te controleren als een proxy voor koolstof fixatie potentieel en metabolische veelzijdigheid in het Lake Bonney verrijking culturen.

Protocol

1. Afnemen van het monster

1. Kies en de voorbereiding van de bemonstering plaats een dag voor bemonstering van de waterkolom. Hierdoor kan de gelaagde lagen van de waterkolom te hervormen na de verstoring als gevolg van boor-en ijs-holes smelten. Identificeer locatie van de boor site door GPS.
2. Om de waterkolom toegang te krijgen, beginnen met het boren van een gat door het ijs met een Jiffy ijs grondboor gekoppeld aan een 4-inch Jiffy vlucht uitbreiding en snijden bit. Om bevriezing van de boor in het gat te voorkomen, proberen te boren stoffen in het vloeibare water door het stopzetten van het boren ongeveer 4-6 cm boven de bovenkant van de waterkolom.
3. Het boorgat moet worden uitgebreid met een diameter van 15 tot 60 cm vóór de bemonstering. Dit wordt bereikt door toepassing van een gat smelter (Hotsy Model) die verwarmd polyethyleenglycol circuleert door een koperen leiding. Hole smelten duurt gewoonlijk tot 18 uur.
4. Voorafgaand aan de bemonstering van de waterkolom, ervoor zorgen dat alle benodigde apparatuur en monster stOrage schepen worden geassembleerd in de bemonstering site. Sampling materialen zijn onder andere: Niskin fles (5-10 L capaciteit), Winch met diepte-gekalibreerde kabel, Messenger, voldoende monsterflessen voor elke bemonstering diepte en koelers voor vervoer van monsters.
5. Begin bemonstering in het begin van de dag (~ 5 uur), als meer water filtering dient te worden ingevuld op de dag van bemonstering. Verzamelen watermonsters (1-5 L) van de gewenste diepte (deze studie: 6 m, 15 m en 18 m bemonstering diepte, gemeten vanaf de piëzometrische waterniveau in het ijs gat) met een Niskin sampler aan een gekalibreerde handlier. Om verstoring van de waterkolom te voorkomen verzamelen geringe diepte voor de diepere.
6. Store meer monsters in koelers en transport van het monster site naar de Field Lab met behulp van een slee aan een ATV (all terrain vehicle). De monsters moeten worden verwerkt of gestabiliseerd (voor oa: flash freeze in vloeibare stikstof) in het veld laboratorium onmiddellijk na de bemonstering.

2. Development van de Verrijking Culturen

1. Voor de teelt van verrijking culturen, Concentreer 0.5-1 L van het meer van water op 47 mm 0,45 pm poriegrootte polyethersulfon filters met zachte filtratie (<0,3 atm). Als de diversiteit van de natuurlijke gemeenschap gewenst is, filteren een tweede monster op 47 mm 0,45 pm poriegrootte polyethersulfon filters en volg de protocollen volgens Bielewicz et al.. ⁴ voor eukaryote fylogenetische diversiteit.
2. Overdracht filter tot 50 ml steriele falcon buis met ~ 20 ml gefilterd water uit het meer verzamelde uit dezelfde steekproef diepte als het filter. Voorzichtig wassen cellen van het filter met een steriele pipet.
3. Overdracht celsuspensie in een 25 cm ² steriele celkweekkolf. Voeg gefilterd water uit het meer verzameld uit elk monster diepte aan de cultuur volume te verhogen tot 45 ml. Stel meerdere replica voor elke bemonsteringsdiepte als verrijkingen op verschillende voedingsbodems gewenst zijn.
4. Supplement cultuur kolven met 50X sterile oplossingen tot een eindconcentratie van 1X de volgende kweekmedia: basismedium Vet's BG11 en F / 2. Als kweken van organismen vereist mixotrophic, opstelling twee F/2-supplemented schepen en voeg 2-3 korrels steriele rijst een van de flessen.
5. Incubeer kweekflesjes bij lage temperatuur (4 ° C) en lage instraling (20 mol fotonen m ^-2 s ^-1) bij een temperatuur-gecontroleerde groei incubator voor ten minste 4 weken in Antarctica voorafgaand aan de verzending van uw Amerikaanse laboratorium. Als isolaten gewenst zijn, plaat 250 ul van verrijking cultuur op agar platen met goede groei media na 2 weken incubatie.
6. Voor verzending naar de VS, overdracht verrijking culturen om steriele 50-ml Falcon buizen. Verzoek verzending vereiste van "niet bevriezen" en "koel houden" op scheepvaart aanvraag. Terwijl het verzendproces van Antarctica is relatief snel (2 weken door commerciële lucht) en de zeer betrouwbare, is er een mogelijkheid van verlies van veeleisende orgelorganismen tijdens het transport proces. Zo kan onderzoekers willen een subgroep voor te behouden voor de scheepvaart, zodat het verlies van bepaalde soorten tijdens het verzenden kan worden beoordeeld.
7. Bij aankomst in de VS, 5 ml van verrijking cultuur in 45 ml van de goede groei media in een 125-ml steriele erlenmeyer afgedekt met een steriel gaas. Verrijking culturen moeten worden gehandhaafd als staande culturen in een temperatuur gecontroleerde milieu groeikamer (Dagelijkse Groei kamer, VWR) bij 4 ° C/20 mol fotonen m ^-2 s ^-1. Culturen moeten worden overgebracht naar vers medium om de 30 dagen.

3. Cellysaat Extractie van een gefilterde verrijkingen

1. Filter 5 ml van verrijking cultuur op een 25 mm Whatman GF / F filter met zachte vacuüm (<10 psi). Het filter kan worden opgeslagen enkele weken bij -80 ° C voorafgaande aan het testen RuBisCO activiteit.
2. Snijd de filter in 4-5 secties met steriele stalen schaar enoverdragen stukken met een steriel pincet een 2 ml schroefdop buis gevuld een vijfde van de wijze vol 0,1 mm zirkoniumoxide / silica kralen.
3. Voeg 1,25 ml filter extractie buffer (50 mM bicine, 10 mM _MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, en 0,1% Triton X-100; plaats vers: 10 mM NaHCO _3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocapronzuur zuur, 0,7 mm benzamidine, pH 7,8) ¹³ en verstoren cellen met behulp van een klopper Minibead drie keer 30 seconden op snelheid instelling 48. Om de verwarming van het monster, alternatieve beadbeating voorkomen met 1 min. ijs incubatie.
4. Centrifugeer filter slurry gedurende 2 min bij 3000 x g bij 4 ° C een losse pellet van GF / F filter vezels en celwand vuil vormen.
5. Verwijder een 200 pi aliquot en onderdompelen in 800 pL ijskoude 90% aceton. Meet extraheerbare chlorofyl (CHL) een in een spectrofotometer bij een golflengte van 664 nm waarden en 647 nm ^14. Breng de supernatant met een 1,5 mL microcentrifugebuisje.
6. Centrifugeer remaining supernatant bij 4 ° C gedurende 2 min bij 15.000 xg en overdragen supernatant (vermijden van onoplosbare pellet celmembranen en resterende GF / F filter vezels) naar een 1,5 ml microcentrifugebuisje. Deze oplosbare cellysaat kunnen nu in de carboxylase-activiteit RuBisCO assay.
7. Lysaat worden opgeslagen bij -80 ° C na toevoeging van 12,5% glycerol en flash invriezen in vloeibare stikstof. Een verlies van activiteit voorkomen na meerdere vries / ontdooi cycli afhankelijk van de gevoeligheid van de enzymen in het lysaat. Daarom moet de activiteit van verse versus bevroren lysaat worden getest voordat op grote schaal cellysaat extracties.

4. RuBisCO carboxylase-activiteit Filter Assay

1. Overdracht 125 pi van oplosbare lysaat om een ​​15 ml schroefdop microcentrifugebuis (cap niet nodig), dat is gekoeld op ijs. Bij negatieve controlemonsters, voeg 125 ul oplosbare lysaat tot 15 ml schroefdop microcentrifugebuis, maar voegen geen substraat (in stap 4.7). Lopendupliceren reacties voor alle monsters en negatieve controles.
2. Bereid 10 ml verse testbuffer (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO _3, 25 mM _MgCl2) en zet op ijs. Aliquot genoeg van de test buffer voor alle monsters en negatieve controles (100 ul per monster / plus 100 pl extra) een 5 ml buis. Voer alle volgende stappen onder een zuurkast.
3. Voeg 40 uL NaH ¹⁴ CO ₃ (500 uCi / ml) per ml testbuffer aan de hoeveelheden verdeeld buffer en houden de buffer op ijs.
4. Verwijder 10 pi van de test buffer bevattende ¹⁴ C en verdund in 1 ml test buffer. Na het omkeren om te mengen, voeg 100 ul van de verdunde mengsel 1:100 tot en met 3 ml Bio-Safe II scintillatietelling cocktail in een scintillatieflesje. Omkeren om te mengen. Scintillatie telt (Beekman LS6500) moet meer dan 18.000 cpm voordat u verder gaat met de test.
5. Bij voldoende NaH ¹⁴ CO ₃ is toegevoegd aan de test buffer,verplaatsen reactiebuizen een droog bad ingesteld op 25 ° C en incubeer 3-5 minuten.
6. Voeg 100 ul assay buffer de lysaten en geïncubeerd 5 minuten bij 25 ° C.
7. Voeg 20 pi 15 mM ribulosedifosfaat, monsters en laat de reactie doorgaan 5-10 minuten bij 25 ° C.
8. Voeg 100 ul propionzuur (100%) (Fisher) om de reactie te stoppen. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 2.000 xg van feitelijke ¹⁴ C. uitputten
9. Breng het totale volume van de monsters naar scintillatieflesjes met 3 ml Bio-Safe II scintillatietelling cocktail. Bepaal cpm van zure stabiele eindproducten door scintillatietelling (B. Witte, R. Tabita persoonlijke communicatie).
10. Bereken RuBisCO de activiteitsgraad op een chl een basis ^14.

5. Representatieve resultaten

We benut verrijking kweken aan koude aangepaste fototrofe en mixotrophic protisten die in de Antarctische L isolerenake Bonney. Om een grotere diversiteit aan organismen vast te leggen, we hebben getest drie groeisectoren mediatypen: basismedium Stoute (BBM) ^15, F/2-Si Marine Medium ^{16, 17} en BG11 Medium ^18. Visuele inspectie van de verrijkingscultures met lichtmicroscopie gebleken dat de culturen werden bepaald door phototrophic protisten (aangegeven door de aanwezigheid van chlorofyl pigment in de meeste cellen) en koesterde verschillende cel morfologie afhankelijk van de opname diepte van de inoculum was genomen en de papiersoort in de cultuur (Fig. 1).

We gemeten maximale tarieven van de carboxylase-activiteit gekatalyseerd door het enzym RuBisCO als een proxy voor koolstoffixatie potentieel. Chl een overvloed werd ook gecontroleerd als een schatting van fototrofe protisten biomassa (afb. 2). Ondanks de teelt van alle culturen onder dezelfde temperatuur / licht regime (dat wil zeggen 4 ° C/20 mol m ^-2 s ^-1), koolstoffixatie potentiëleen fototrofe biomassa varieerde aanzienlijk tussen de verrijking culturen. Maximale RuBisCO activiteit werd waargenomen in verrijking culturen groeien in zowel BBM (verrijkingen 4 en 6) of BG11 (verrijkingen 13 en 14) de groei media, terwijl culturen verrijkt op F / 2 groeimedium (verrijkingen 19, 21, 23) vertoonden een 4 - tot 34-voudig lagere maximale carboxylase activiteiten. Deze verschillen waren niet te wijten aan lagere biomassa niveaus in de F / 2 culturen, zoals carboxylase-activiteit werd uitgedrukt op een Chl een basis. Bovendien hebben RuBisCO activiteit niet correleren met chl een concentratie (r = -0,023, p> 0,1;. Figuur 2, inzet). De BBM culturen geënt met water uit het meer van 6 m en 15 m (verrijkingen 4 en 5) hadden de hoogste chl een niveau, terwijl alle andere culturen vertoonde een relatief lage chl a, ongeacht RuBisCO enzymactiviteit (afb. 2).

Figuur 1.Vertegenwoordiger microbiële eukaryote verrijking culturen die hebben gekozen voor de groei van verschillende organismen. De identiteit van de cultuur in de linker van de panelen. Alle beelden zijn licht microfoto gegenereerd met behulp van olie-immersie bij 1000 x vergroting.

Figuur 2. Potentiële koolstoffixatie capaciteit en extraheerbare chlorofyl a concentraties in Antarctische microbiële eukaryote verrijking culturen geïsoleerd van Lake Bonney en geteeld op verschillende voedingsbodems. Zie tabel 1 voor cultuur meer informatie Inzet:. Pearson correlatie tussen chlorofyl a overvloed en koolstoffixatie potentieel in Antarctische microbiële eukaryote verrijking culturen.

Discussie

De recente moleculaire studies hebben gerapporteerd grote diversiteit van eencellige eukaryoten een heel scala van omgevingen ^{3, 19, 20,} maar als gevolg van een gebrek aan isolaten over de volle breedte van protisten habitats de functionele rol van deze individuele soorten in voedselwebben zijn grotendeels onbekend. In deze studie hebben we beschreven methoden te verrijken voor microbiële eukaryote soorten vertonen metabolische veelzijdigheid van een relatief undersampled omgeving, een permanent ijs bedekte A...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
BBM	Sigma	B5282
BG11	Sigma	C3061
F / 2	Sigma	G9903
GF / F filter 25 mm	Fisher Scientific	09-874-64
GF / F filter, 47 mm	Fisher Scientific	09-874-71
Polyethersulfon filter, 0,45 um porie 47 mm	Pall Life Sciences	61854
Steriele celkweekkolf, 25 cm 2	Corning	430639
Diurnal groeikamer	VWR	35960-076
Zirconia / silica kralen, 0,1 mm middellijn	BioSpec Producten	11079101z
Mini-Bead klopper	BioSpec Producten	3110BX
Schroefdop microcentrifugebuis (1,5 pi)	USA Wetenschappelijk	1415-8700
NaH 14 CO 3	ViTrax	VC 194	Houd in porties van 400 ul bij -20 ° C
RuBP	Sigma	R0878-100mg	Los in 10 mM Tris-propionzuur (pH 6,5)