Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

Samenvatting

Een effectieve methode voor het enten van weefsel van gedefinieerde en consistente grootte tussen planaria wordt beschreven. Ook inbegrepen is een beschrijving van de immobilisatie technieken gebruikt voor transplantatie kan worden aangepast in samenhang met lood schilden de gedeeltelijke bestraling van levende dieren.

Samenvatting

De planarian, een zoetwater platworm, heeft bewezen een krachtig systeem voor het ontleden van metazoïsche regeneratie en stamcel biologie ^1,2 te zijn. Planarian regeneratie van ontbrekende of beschadigde weefsels wordt mogelijk gemaakt door volwassen stamcellen genoemd neoblasts ^3. Hoewel deze stamcellen is definitief aangetoond dat ze pluripotent en singulier in staat om bij de reconstructie van een heel dier ^4, de heterogeniteit binnen de stamcellen bevolking en de dynamiek van hun cellulaire gedrag blijven grotendeels onopgelost. Door het grote aantal en de brede verspreiding van stamcellen in de planarian lichaam plan worden geavanceerde methoden voor het manipuleren van subpopulaties van stamcellen voor Moleculaire en functionele studie in vivo nodig.

Weefseltransplantatie en gedeeltelijke bestraling twee methoden waarbij een subpopulatie van planarian stamcellen kunnen worden geïsoleerd voor verder onderzoek. Elke techniek heeft duidelijke voordelen. Tafgifte transplantatie kan de invoering van stamcellen in een naïeve gastheer die een inherent genetisch verschillende of eerder farmacologisch behandeld. U kunt ook een gedeeltelijke bestraling zorgt voor de isolatie van stamcellen binnen een host, naast elkaar aan het weefsel verstoken van stamcellen, zonder de invoering van een wond of een stuitligging in weefsel integriteit. Met behulp van deze twee methoden kan men onderzoeken de cel autonome en niet-autonome factoren die de controle stamcellen functies, zoals proliferatie, differentiatie en migratie.

Beide weefseltransplantatie ^5,6 en gedeeltelijke bestraling ⁷ zijn van oudsher gebruikt bij het ​​definiëren van veel van de vragen over planarian regeneratie die nog in studie vandaag. Echter, deze technieken bleef als gevolg van de moeizame en inconsistente karakter van de voorgaande methoden onderbenut. De protocollen die hier voorwaarts betekenen een grote stap in het verminderen van de tijd eennd inspanning die nodig is om reproduceerbaar te genereren van grote aantallen geënt of gedeeltelijk bestraalde dieren met efficacies bijna 100 procent. We hebben het de cultuur van grote dieren, immobilisatie, voorbereiding voor gedeeltelijke bestraling, weefseltransplantatie, en het optimaliseren van dierlijke herstel. Bovendien is de hier beschreven werk demonstreert de eerste toepassing van de partiële bestraling werkwijze voor het meest bestudeerd planarian, Schmidtea Mediterranea. Bovendien, efficiënte weefsel enting in planaria opent de deur voor het functioneel testen van subpopulaties van naïeve of behandelde stamcellen in repopulatie assays, die al lange tijd de gouden standaard methode voor het testen van volwassen stamcellen potentieel in zoogdieren ^8. Brede acceptatie van deze technieken zal ongetwijfeld leiden tot een beter begrip van de cellulaire gedrag van volwassen stamcellen in weefsel homeostase en regeneratie.

Protocol

Let op: dit protocol suggereert het gebruik van potentieel gevaarlijke stoffen (lood en chloreton). Ophalen, lezen, en volg MSDS voor alle potentieel gevaarlijke stoffen.

1. Animal Cultuur, selectie en voorbereiding

1. Voor dierlijke cultuur en de behandeling gebruik planarian water (1X Montjuïc zouten ⁹⁾ en kunststof overdracht pipetten.
2. Seksuele biotype Schmidtea mediterranea kan worden gebruikt wanneer opgegroeid in het laboratorium onder normale kweekomstandigheden ^10. Om aseksuele exemplaren van vereiste afmetingen te produceren, S. Mediterranea verhoogde bij kamertemperatuur onder normale omstandigheden ⁹ moet worden gevoerd op het dubbele tot drievoudige normale frequentie (2-3 keer per week) voor een tot twee maanden voorafgaand aan het gebruik. Als alternatief kan aseksuele dieren die bij normale frequentie worden bewaard bij 10 ° C onbeperkt om de gemiddelde grootte.
3. Kies dieren die 1 tot 2 cm inlengte groter dan 2 mm dan sterven dieren 3-7 dagen vóór gebruik.
4. Als het uitvoeren van een farmacologische of radiologische behandelingen het beoogde gastheren, donoren, of gedeeltelijk bestraalde dieren, uit te voeren behandeling (en) op dit punt.
5. Als farmacologische behandelingen werden uitgevoerd dat nodig voedersysteem, verhongeren dieren nog eens 3 tot 7 dagen vóór gebruik.

2. Voorbereiding van oplossingen en materialen

1. Bereid chloreton oplossing, een lichte lokale verdoving, door oplossen 0,1-0,2% w / v chloreton in planarian water en koelen van de oplossing op ijs.
2. Als het uitvoeren van een gedeeltelijke bestraling alleen, ga dan naar stap 2.7. Voor weefseltransplantatie verder tot 2,3 stap.
3. Met een Bunsen-brander, buigt 0,75 mm inwendige diameter voor het doorsnijden van de ent weefsel en 0,7 mm buitendiameter, gebruikt om een ​​gat in de gastheer waarin het transplantaat, capillaire buizen tot een hoek van 90 ° zal ontvangen 1-2 cm het einde van each buis. Om materiaal te slaan buig beide uiteinden van elk capillair en breken in tweeën twee instrumenten produceren. Zorg ervoor dat u vlam de uiteinden van de buizen.
4. Snijd de volgende documenten naar de aangegeven maten:
   • Black papieren filter (snijd in rechthoeken ca. 2,5 cm x 1,5 cm)
   • Whatman # 3 papieren filter (snijd in rechthoeken ca. 2 cm x 0,5 cm)
   • Kimwipe (gevouwen en snijd ze in ca. proppen. 3 cm x 0,5 cm x 4 ply)
   • Sigaretten vloei (verwijder gom strip en snijd ze in rechthoeken ca. 3 cm x 2 cm)
5. Bereid gemodificeerde Holtfreter de oplossing (3,5 g / L NaCl, 0,2 g / L NaHCO ₃ 0,05 g / L KCl, 0,2 g / L _MgSÛ4, 0,1 g / L _CaCl2, pH 7,0 tot 7,5) en caseïne verzadigde Holtfreter-oplossing en kou zowel 4 ° C.
6. Bevestig een gevouwen Kimwipe tot een vierkant van Parafilm en leg ze op Peltier koeler etiket of een ander koelsysteem zich onder een stereomicroscoop. Verzadig de Kimwipe met gekoeld Holtfreter's oplossing en plaats twee zwarte filtreerpapier rechthoeken op de Kimwipe.
7. Line petrischalen met Whatman # 2 filtreerpapier. Bevochtig het filtreerpapier met de oplossing Holtfreter en chillen de gerechten op het ijs. Bij gedeeltelijke bestraling een grotere schaal en filtreerpapier voering kan worden toegepast.

3. Verdoving en immobilisatie

1. Vul een petrischaal met gekoelde chloreton oplossing en pipet wormen in de schaal. Voor de transplantatie slechts verdoven een host en een donor per keer. Bij gedeeltelijke bestraling vele (> 10) dieren verdoofd tegelijk.
2. Laat wormen om te genieten in de chloreton oplossing totdat ze onbeweeglijk (5-10 min).
3. Spoel wormen door pipetteren ze in een schaal gevuld met de oplossing gekoeld Holtfreter's.
4. Immobiliseer dieren door pipetteren ze op zwarte papieren filter verzadigd met de oplossing gekoeld Holtfreter en oriënteren ze ventrale zijde naar beneden met een pincet. Als dieren zijn in staat om locomote, genieten van overtollige Holtfreter's oplossing, licht afnemen van de temperatuur van uw Peltier of koude plaat, of de lengte van chloreton behandeling.

4. Gedeeltelijke Bestraling

Opmerking: Volg deze stappen om dieren voor te bereiden op een gedeeltelijke bestraling. Als het uitvoeren van de transplantatie in plaats daarvan, gaat u naar sectie 5.

1. Plaats een gekoelde petrischaal vanaf stap 2.7 op ijs in een ijsemmer die past in een top bron X-ray bestraler.
2. Leg verdoofde dieren in een petrischaal meteen op het filtreerpapier waarop ze zijn geïmmobiliseerd. Met behulp van een tang om direct naar verdoofd wormen waardoor ze geblesseerd raken.
3. Transport aangebracht dieren naar een top-source röntgen bestraler en situeren de koeler, dat de afstand van de kathode buis de dieren wordt geminimaliseerd, waardoor maximale effectieve dosering.
4. Plaats loodafscherming (s) (figuur 1) tussen de dieren en de kathode tUbe zoals gewenst. Shields moet 4,5 tot 6 mm, zodat voor 97 tot 99% demping van een 325kV röntgenbundel ¹¹ zijn.
5. Lever X-ray dosis. Als volledige stamcellen ablatie van niet-afgeschermde gebieden gewenst, leveren 30 Gy of meer met een X-ray bestraler. Als referentie 30 Gy gelijk aan 3,6 minuten op 320 kilovolts en 10 mA in Precision X-Ray Inc XRAD320 met een veld-naar-bron afstand van 30 cm.
6. Onmiddellijk na toediening is voltooid, het hanteren van wormen door de zwarte filtreerpapier, overdracht dieren in gekoeld planarian water. Laat het planarian water opwarmen tot kamertemperatuur en de dieren zich los van de zwarte filtreerpapier. De gedeeltelijke bestraling is nu voltooid.

5. Weefseltransplantatie

1. Met behulp van een transfer pipet en tang, regelen verdoofd gastheer en donor wormen op aparte rechthoeken van zwart filter papier op de Kimwipe die is afgekoeld op de PeltiER of koeler plaat onder de stereomicroscoop.
2. Met behulp van een 0,75 mm binnendiameter capillair knip de graft stekker uit het donor-en, met behulp van een tang, plaats het op een uit de weg gedeelte van de gastheer. Als graft materiaal vast komt te zitten in het capillair, los met een pincet.
3. Met behulp van een 0,7 mm buitendiameter capillair een stekker uit het gastland en het gebruik van een tang positie van het transplantaat in het gat dat achter wordt gelaten.
4. Breng de getransplanteerde host op zijn zwarte filtreerpapier rechthoek in de petrischaal bereid in stap 2.7.
5. Bevochtig een stuk vloei met de oplossing verzadigde caseïne Holtfreter's en plaats deze op de top van de getransplanteerde host als diagramed in figuur 2A.
6. Geniet van vier stukken van een papieren filter in caseïne verzadigde oplossing Holtfreter en zet je de getransplanteerde host als diagramed in figuur 2B.
7. Geniet van vier proppen gesneden Kimwipe in caseïne verzadigde oplossing Holtfreter's en leg ze overhet filtreerpapier van stap 5.6 (Figuur 2B). Plaats het deksel en zet de petrischaal op ijs.
8. Breng de donor worm in planarian water om te herstellen, te genezen en te regenereren.
9. Als alle transplantaties zijn voltooid, de getransplanteerde wormen 's nachts plaats in een 10 ° C incubator.
10. De volgende ochtend, zorg ervoor dat u het transplantaat te verstoren, ontdek de worm en over te dragen het (op zijn zwarte filter papier) naar een petrischaal gevuld met planaria water.
11. Ofwel kan de worm zich los uit het filter papier of voorzichtig te verwijderen met een pincet.
12. Wijzig de planarian water eens in de 2-3 dagen.

6. Representatieve resultaten

Onmiddellijk na de gedeeltelijke bestraling planaria verschijnt normaal en onaangetast. Afhankelijk van de toegediende dosis en de geometrie van de gebruikte afscherming kan bestraalde weefsel zelfs achteruit en desintegreren ^7. Afgeschermde weefsel moet intact blijven. Folldoor weefsel regressie en een verlies van weefsel integriteit, zal een blastema te vormen en ontbrekende structuren zullen worden geregenereerd (Figuur 3A). Indien een amputatie in de gedeeltelijk bestraalde gebied wordt het bestraalde weefsel worden gered (dus verhinderd regressie of vermalen) (Figuur 3B). In zowel de onbeschadigde de amputatie geval regeneratie wordt vertraagd ten opzichte van een afgezet niet-bestraalde planaria (Figuur 3C). Als een röntgendosis 30 Gy werd geleverd en gedeeltelijk bestraalde dier was onbeschadigd succesvolle stamcellen ablatie in een patroon dat overeenkomt met de gebruikte loodafscherming kan 2 a 3 dagen worden bevestigd na gedeeltelijke bestraling door in situ hybridisatie voor de stamcellen marker Smed-Piwi-1 ¹² (aka smedwi-1) (figuur 4).

De ochtend na de transplantatie, een succesvolle transplantatie van het getransplanteerde weefsel zou duidelijk moeten zijn wautorotatie de host weefsel, hebben gehandeld op grond van zowel de dorsale en ventrale oppervlak van de gastheer (figuur 5A). Soms zal het transplantaat zich alleen de ventrale of dorsale zijde. Als de transplantatie werd resultaat oplevert, geen teken van het transplantaat zichtbaar, hetzij dorsale of buikoppervlakte van de gastheer (figuur 5B). Kort na een succesvolle graft van onbestraald weefsel in een gastheercel die was van stamcellen geablateerd door dodelijke bestraling ^13,14 in situ hybridisatie voor Smed-Piwi-1 dat stamcellen aanwezig zijn geven voornamelijk in het transplantaat (figuur 5C ). Daarnaast zal een succesvolle transplantatie van niet-bestraalde weefsel in dodelijk bestraalde gastheren leiden tot een redding van gastheerweefsel en lange termijn overleven van de gastheer ^15.

Figuur 1. Algemene opstelling van basiscomponents een gedeeltelijke doorstraald. een röntgenfoto bestraler met een top gepositioneerd röntgenbron (kathode buis) verdoofde planarian wordt direct onder de röntgenbron in het bestralingsveld. Om de röntgendosis maximaliseren, dient de afstand tussen de planarian en de röntgenbron worden geminimaliseerd. Een loodafscherming moet worden geplaatst tussen de kathode en de buis verdoofde worm, zo dicht mogelijk bij de worm praktisch. De lead schild moet worden ontworpen, geproduceerd en zo, dat er schermt de gewenste weefsel, maar volledig bloot de rest van de worm. Veel commerciële produceert zal produceren op maat lood schilden uit je eenvoudig ontwerp diagram, we hebben met succes gebruikt Alpha Systems Corp (Bluffdale, UT). De kabel moet voldoende dik zijn om de gewenste hoeveelheid afscherming. Als bijvoorbeeld bij volledige afscherming van 320 kV röntgenbundel gewenst is, dient de leiding zijn 4.5-6 mm dik. De planarian en schild zijn geplaatst opeen Holtfreter de doordrenkte papieren filter gevoerd petrischaal die rust in een ijsemmer. Bij een voldoende grote röntgenbestraling veld en een aantal identieke lood schilden kunnen veel monsters gedeeltelijk bestraald tegelijk (niet afgebeeld).

Figuur 2. Het bouwen van de recovery kamer. (A) Een opengewerkte tekening van de weefseltransplantatie recovery kamer, met alle componenten die op de top van elkaar lagen na weken in caseïne verzadigde oplossing Holtfreter's. (B) Een bijna afgerond recovery kamer, ter illustratie van de in elkaar grijpende plaatsing van de Whatman # 3 filtreerpapier rechthoeken, die strak zet je de verdoofde planarian, het voorkomen van beweging tijdens de genezing. De zorgvuldige opbouw van het herstel kamer zorgt ervoor dat de verplaatsing van dieren en verdroging, het bevorderen van een snelle genezing en een grotere effectiviteit van weefseltransplantatie.

Figuur 3. Representatieve resultaten eenvoudige achterste deel bestraling. Zoals Dubois ⁷ beschreven (A) bij de achterste helft van planarians waren afgeschermd met lood en vervolgens blootgesteld aan x-ray bestraling de voorste weefsel waargenomen terug regressie de grens tussen de bestraalde en afgeschermde weefsel op welk punt ongepigmenteerde blastemas gevormd en de dieren begon te regenereren. (B) aan de andere kant, wanneer de dieren werden onthoofd volgens dezelfde gedeeltelijk bestraling uitgevoerd (A) weefsel regressie werd niet waargenomen en de resterende bestraalde voorste weefsel gered. De onthoofd gedeeltelijk geregenereerde bestraalde dieren koppen (B) werd echter regeneratie aanzienlijk vertraagd ten opzichte bestraald onthoofd controles (C).

Figuur 4. Vertegenwoordiger outcomij over de gedeeltelijke stamcellen ablatie na de gedeeltelijke bestraling. Hele-mount in situ hybridisatie (WISH) voor de stamcel marker Smed-Piwi-1 blijkt dat wild-type planaria hebben stamcellen verdeeld over hun lichaam, met uitzondering van het weefsel van de voorste fotoreceptoren (pijlpunt) en de keelholte juiste (asterisk) ^14. (A) voor Smed-Piwi-1 WISH in bestraalde maar volledig afgeschermd controle planaria vast drie dagen na bestraling toont een stamcel distributie die is niet te onderscheiden van die van de wild-type planaria. (B) Anderzijds, wens Smed-Piwi-1 in dieren die slechts gedeeltelijk afgeschermd, waardoor de voorste en achterste blootgesteld, maar zijn ook opgelost drie dagen na bestraling blijkt dat stamcellen geablateerd van de niet-afgeschermde gebieden . Schaal bars zijn 500 micron.

Figuur 5. EXAmples van succesvolle en mislukte weefseltransplantatie. (A) Live beelden van de dorsale en ventrale uitzicht op een succesvol getransplanteerd planarian drie dagen na de transplantatie. De ent (aangegeven) is duidelijk zichtbaar op zowel de dorsale en ventrale oppervlakken en is omgeven met karakteristieke ongepigmenteerde weefsel op de graft-host-interface. (B) Dienovereenkomstig, mislukte transplantaties geen zichtbare ent weefsel op de transplantatie site (aangegeven) en in plaats daarvan laten een genezen, ongepigmenteerde, laterale wond van de mislukte transplantatie. Entstuk die voldoet alleen dorsale of de buik van een succesvolle transplantatie (A), gezien vanaf de ene zijde en een mislukte transplantatie (B), gezien vanaf de andere lijken. (C) Bij het ​​wild type (WT) weefsel wordt geënt in een bestraald host die is ablatie van de aldaar gevestigde stamcellen en de getransplanteerde stamcellen worden later onthuld door WENS voor de Smed-Piwi-1 twee dagen na de transplantatie,Het succes van de transplantatie duidelijk weergegeven door de specifieke aanwezigheid van stamcellen alleen of in het transplantaat locatie (pijlen). Schaal bars zijn 500 micron.

Discussie

Het belang van immobilisatie

Immobilisatie verreweg de belangrijkste stap voor de succesvolle voltooiing van een van deze processen. Als planaria zijn niet goed voor een gedeeltelijke bestraling geïmmobiliseerd, kan ze bewegen onder de leiding schild, het produceren van inconsistente en verwarrende resultaten. Bovendien, als dieren worden onvoldoende geïmmobiliseerd na transplantatie, zal de gastheer worm waarschijnlijk af te stappen van het transplantaat weefsels, wat resulteert in het falen v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
General Purpose transferpipet	Samco	691
Capillairen (ID 0,75 mm)	FHC	30-30-0
Capillairen (OD 0,7 mm)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
Black filtreerpapier	Schleicher & Schuell	10310809
Whatman # 2 filtreerpapier 1002-055	Fisher Scientific	09-810B
Whatman # 3 filtreerpapier 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
Sigaretten vloei	Zig-Zag, originele	NA
Petriborden	VWR	82050-544
Tang DUMONT, INOX # 5	FST	11251-20
Chloreton	Sigma Aldrich	112054
Caseïne	Sigma Aldrich	C3400
Lood Shields	Alpha Systems Corp, Bluffdale, UT	Eigen ontwerp
XRAD-320 Biologische bestraler	Precisie X-Ray, North Branford, CT	NA