Karakterisering van moleculaire mechanismen van<em&gt; In vivo</em&gt; UVR Induced Cataract

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Karakterisering van moleculaire mechanismen van

9.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4016

⸱

28 november 2012

Konstantin Galichanin¹^,² , Nooshin Talebizadeh² , Per Söderberg²

¹St. Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, ²Gullstrand lab, Section for Ophthalmology, Department of Neuroscience, Uppsala University

In dit artikel

Samenvatting

Cataract is de belangrijkste oorzaak van blindheid in de wereld. UV-zonnestralen (UVR) is de belangrijkste risicofactor voor de ontwikkeling van cataract. Een diermodel van ver UVR-B geïnduceerde cataract ontwikkeld. In dit artikel beschrijven we methoden voor onderzoek naar cataract: blootstelling aan UVR, kwantitatieve RT-PCR en immunohistochemie.

Samenvatting

Cataract is de belangrijkste oorzaak van blindheid in de wereld ^1. De World Health Organization definieert cataract als een vertroebeling van de lens van het oog die de overdracht van licht belemmert. Cataract is een multifactoriële aandoening is in verband met diabetes, roken, ultraviolette straling (UVR), alcohol, ioniserende straling, steroïden en hoge bloeddruk. Er is een sterke experimentele ^2-4 en epidemiologische bewijzen dat ^5,6 UVR cataract veroorzaakt. Wij een diermodel voor UVR B geïnduceerde cataract in zowel verdoofd ⁷ en niet-verdoofde dieren ^8.

De enige remedie voor cataract is een operatie, maar deze behandeling is niet voor iedereen toegankelijk. Er is geschat dat een vertraging van het begin van cataract 10 jaar zou de noodzaak voor cataractchirurgie met 50% ^9. Om de incidentie van cataract vertragen, is het nodig om de mechanismen van cataract te begrijpen en vinden effectieve preventie strategies. Onder de mechanismen voor cataract ontwikkeling apoptose speelt een cruciale rol bij de initiatie van cataract bij mensen en dieren ^10. Onze focus is onlangs apoptose in de lens als het mechanisme voor de ontwikkeling van cataract ^8,11,12. Verwacht wordt dat een beter begrip van het effect van UVR op de apoptose route zal mogelijkheden bieden voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen te voorkomen cataract.

In dit artikel beschrijven we hoe cataract kan experimenteel geïnduceerd worden door in vivo blootstelling aan UVR-B. Verdere RT-PCR en immunohistochemie worden gepresenteerd als hulpmiddel om de moleculaire mechanismen van UVR-geïnduceerde cataract B bestuderen.

Protocol

1. Blootstelling aan ultraviolette straling

15 min voor de opname verdoven een vrouwelijke Sprague-Dawley rat met een mengsel van 90 mg / kg Ketalar (ketamine) en 10 mg / kg Rompun (xylazine) door intraperitoneale injectie.
Plaats het dier in een rat restrainer en draai de riemen tot immobilisatie van de rat zonder dat een boomstam squeeze ^13.
Instill Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, in beide ogen van de rat mydriasis induceren.
Plaats het dier, zodat een oog is geplaatst tegen een smalle bundel UVR bij 300 nm ¹⁴ met 10 nm breedte op halve hoogte en beschermen de contralaterale oog met zwarte tape.
Expose de rat eenzijdig sub-threshold dosis 1 kJ / m ² UVR-B bij 300 nm gedurende 15 minuten ^15.

2. Ontleding

Na voorafbepaalde na blootstelling interval (1, 5, 24 en 120 uur), offeren zes weken oude ratten (gewicht <200 g) door carbon dioxide stikken of breken van de halswervels.
Ophelderen ogen. Daarna neer te zetten in het oog hoornvlies, posterieure zijde naar boven. Dan stoot een minimale gat door het toepassen van een 27 gauge canule en druk tangentiaal aan de sclera om te voorkomen dat schade aan de lens die zeer dicht bij de sclera. Maak dan gebruik van een paar van oogheelkundige chirurgie schaar om de omtrek snijden net achter de limbus tot het achterste gedeelte van de sclera kan worden getild. Til de lens met een stomp gebogen tang.
Verwijder resten van het corpus ciliare van de lens equator onder een microscoop, waarbij de lens in gebalanceerde zoutoplossing niet meer dan 5-10 min.

3. Kwantitatieve RT-PCR

Plaats een lens in een mix van 350 ul lysis buffer RA1 (NucleoSpin RNA II totaal RNA isolatie kit) en 3,5 ul β-mercaptoethanol in een 2 ml Eppendorf buisje.
Houd de lens in deze mix gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
Homogeniseer de lens meteen naald tot enige harde kern van de lens is links van de lens (cortex en capsule van de lens gelyseerd in de lysisbuffer). Verwijder de kern van de mix.
Store monsters onmiddellijk bij -70 ° C.
Ontdooi de monsters en volg het protocol "Totaal RNA zuivering uit gekweekte cellen en weefsels" (NucleoSpin RNA II totaal RNA isolatie kit).
Store RNA monsters bij -70 ° C.
Om voldoende verwijdering van DNA van elk monster te verifiëren, uitvoeren van een PCR onder de volgende voorwaarden (stap 1: 95 ° C gedurende 2 min; stap 2 gedurende 40 cycli: 95 ° C gedurende 20 sec, 55 ° C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 20 sec, stap 3: 72 ° C gedurende 7 min) met p53 DNA primers, voorwaarts 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'en reverse 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' en Taq DNA polymerase (dNTPack) volgens de fabricage protocol. De verwachte PCR product is 243 baseparen.
Voer een 1,5% agarose gelelektroforese om DNA specifieke PCR product van 243 basenparen detecteren. Voor te bereiden1,5% agarose gel in TBE buffer nemen 3,75 g agarose en oplossen in 250 ml TBE buffer. Voeg ethidiumbromide (0,5 mg / ml) 500 pi in 500 ml 1,5% agarose gel oplossing. Verwarm het mengsel in een magnetron en roer om de agarose op te lossen.

Geen van de monsters moet elke DNA specifieke PCR producten onthullen op 1,5% agarose gelelektroforese.

Concentratie van RNA monsters (1 pi) en de verhouding van het monster absorptie bij 260 nm (RNA) en 280 nm (proteïne) in een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. Als de verhouding van RNA tot eiwit RNA monster absorptie van 2,0 of meer dan de RNA monster zuiver is. Als de verhouding van RNA monster absorptie lager dan 2,0, opnieuw RNA zuiveringsstap 3.5.
Neem een zodanige hoeveelheid RNA monster overeenkomend met 1 ug cDNA synthetiseren en volgens het protocol 1 ^st Strand cDNA synthese kit (1 ^st Strand cDNA Synthesis Kit voor RT-PCR).
Bewaar cDNA monsters bij -20 ° C(Voor een periode van 1 jaar en bewaren bij -70 ° C).
Run kwantitatieve real-time PCR op ICycler MyiQ Een kleur Real Time PCR detectie systeem. Belasting drievoud op 96-well plaat met 1 pi cDNA monster TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay voor caspase 3, volgens de instructies vervaardigen. Belasting drievoud op een andere plaat met 96 putjes met 1 pi cDNA monster TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay voor 18s volgens instructies (TaqMan Gene Expression Assay Protocol) productie. Verdun in serie een fractie van cDNA van drie willekeurig gekozen niet-belichte lenzen. Lopen samen met seriële verdunningen van cDNA monsters in een 96-well plaat.
De standaard curve werkwijze voor kwantificering van de resultaten. Het aantal cycli bij drempel fluorescentie wordt gebruikt als meting MyiQ software. Een standaard kromme waarin aantal cycli bij drempel als functie van relatieve concentratie van kalibrator is established voor de seriële verdunningen in elke plaat. cDNA van drie onbehandelde monsters lens werd gebruikt voor kalibratie. Relateren de drempel aantal cycli voor elk monster voor de standaardcurve om de relatieve concentratie van het monster gemeten cDNA te verkrijgen. Tenslotte krijgen expressie van de doelwitgenen door betreffende de relatieve concentratie van het target cDNA de interne controle 18s cDNA.

4. Immunohistochemische kleuring

Bevestiging
1. Prepareer het oog in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4).
2. Zet het oog in een buis gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA) in ijskoud gedurende 20 minuten. Bereid PFA 4% de dag voordien. Bewaren bij +4 ° C tot gebruik. PFA is vers voor ongeveer een week.
3. Verwijderen PFA met een micropipet. Vervolgens wassen met ijskoud PBS gedurende 20 minuten.
4. Zet het oog in 30% sucrose bij +4 ° C gedurende de nacht.
5. Zet het oog in een beker gevuld met optimale snijtemperatuur (OCT)-medium (Tissue-Tek). Zet het oog op een geschikte plaats voor het snijden.
6. Freeze in OCT-medium op droog ijs.
7. Bewaren bij -70 ° C tot gebruik.
Snijden
1. Plaats de oog voor cryo-snijden in een geschikte vliegtuig.
2. Snijd drie 5 urn dik mid-sagittale secties van een centraal gedeelte van elke lens. Ontdoen tenminste 6 secties tussen opeenvolgende secties voorkom vlekken dezelfde kernen in verschillende secties.
3. Zodra een gedeelte is gesneden plaats voorzichtig een dia bovenop. De sectie moet dan vasthouden aan de dia.
4. Laat de dia's aan de lucht drogen voor gebruik. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot nodig.
Fluorescentie immunohistochemie
1. Laat monsters bereiken kamertemperatuur (5-10 min).
2. Teken randen rond de exemplaren met een PAP-pen (Invitrogen).
3. Laat de rand even drogen (10 min).
4. Label de objectglaasjes.
5. Vocht opnemen in 1 × PBS gedurende 15 minuten.
6. Permeabiliseren in standaardblok oplossing gedurende 30 minuten.
7. Voeg primaire antilichaam (konijn polyklonaal, gekloofd caspase-3 antilichaam Asp175 9661; Cell Signalling Technology, Inc) verdund 1:3,000 in standaard blok oplossing.
8. Opslag in een bevochtigde kamer bij +4 ° C gedurende de nacht.
9. Wassen in PBS door pipetteren (3 x 5 min) of door onderdompeling in een groot bad (> 15 min, 1-2 opent).
10. Voeg secundair antilichaam (anti konijn secundair antilichaam met een specifieke absorptie / emissie-spectrum) verdund 1:300 in de standaard blok oplossing.
11. Wassen in PBS door pipetteren (3 x 5 min) of door onderdompeling in een groot bad (> 15 min, 1-2 opent).
12. Veeg PAP-pen uitstrijkjes.
13. Bewaar in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Vermijd blootstelling aan licht.
14. Voeg een druppel Vectashield en plaats een dekglas op de dia. Vermijd het maken van bubbels.
15. Laat uitharden Vectashield (~ 20 min).
16. Houd secties in het donker.
17. Alle aanstuurgedeelten worden verwerkt in de afwezigheid van primaire antilichaam.
18. Zoek de resultaten binnen enkele uren onder een fluorescentiemicroscoop.
19. Count epitheelcellen 'kernen van de ene kant nucleaire boeg naar de andere kant nucleaire boeg van het objectief. Breng de standaard blauwe filter toe op alle lens epitheel kernen in blauw en een standaard filter dat de uitstoot van het secundaire antilichaam past om te zien de caspase-3 positieve kernen in het groen te zien.
20. Noteer het aantal van alle kernen lens epitheel en het aantal positieve kernen. Tel de cellen drie keer voor elke sectie.