Inductie van Adhesie-afhankelijke signalen met behulp van lage-intensiteit ultrageluid

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de stimulatie van de gekweekte fibroblasten met een lage-intensiteit gepulseerd ultrageluid, die focal adhesion vorming en Rac1 activering door het nabootsen van betrokkenheid van de transmembraan-receptor matrix, syndecan-4-drives. Deze benadering maakt het onderzoek van een succesvolle klinische techniek op cellulair niveau, waardoor het bieden van mogelijkheden voor verfijning van de therapie.

Samenvatting

In meercellige organismen, wordt cel gedrag bepaald door interacties met de extracellulaire matrix. Gevolgen van matrix-betrokkenheid variëren van regulatie van cel-migratie en proliferatie, om afscheiding en zelfs differentiatie. De signalen onderliggende elk van deze complexe voortkomen uit de moleculaire interacties van extracellulaire matrix receptoren op het oppervlak van de cel. Integrinen zijn de prototypische receptoren en een mechanische koppeling tussen extracellulaire matrix en het cytoskelet, en het initiëren enkele hechting afhankelijk signaleringscascades. Wordt echter steeds duidelijker dat extra transmembraanreceptoren functioneren naast de integrinen zowel de integrine zelf en signalen stroomafwaarts regelen. De meest elegante van deze voorbeelden is de transmembraan proteoglycanen, syndecan-4, die met α ₅ β _1-integrine werkt tijdens de hechting aan fibronectine. In vivo modellen demonstraten het belang van syndecan-4 signalering, zoals syndecan-4-knockout muizen vertonen genezing vertraging te wijten aan inefficiënte fibroblast migratie ^1,2. In de wild-type dieren, wordt de migratie van fibroblasten in de richting van een wond veroorzaakt door de verschijning van fibronectine die lekken uit de beschadigde haarvaten en wordt afgezet door macrofagen in beschadigd weefsel. Daarom is er grote belangstelling voor het ontdekken van strategieën die fibronectine-afhankelijke signalering te verbeteren en te versnellen kunnen herstelprocessen.

De integrine gemedieerde en syndecan-4-gemedieerde componenten van fibronectine afhankelijke signalering kan worden gescheiden door het stimuleren van cellen met recombinante fibronectine fragmenten. Hoewel integrine betrokkenheid is essentieel voor celadhesie, worden bepaalde fibronectine-afhankelijke signalen gereguleerd door syndecan-4. Syndecan-4 activeert het Rac1 stuwend signaal ^3, zorgt ervoor dat integrine herverdeling ^1, triggers werving van het cytoskelet moleculen, zoals vinculine, aan focaladhesies ⁴ en veroorzaakt daarbij richting migratie ^3. We hebben gezocht naar alternatieve strategieën voor het activeren van deze signalen en vond dat een lage intensiteit gepulseerd ultrageluid (LIPUS) kunnen de effecten van syndecan-4 betrokkenheid ⁵ na te bootsen. In dit protocol beschrijven we de wijze waarop 30 mW / cm ^2, 1,5 MHz ultrageluid gepulseerd bij 1 kHz (fig. 1) kan worden toegepast fibroblasten in kweek (fig. 2) Rac1 activering en focal adhesievorming induceren. Ultrasound stimulatie wordt toegepast maximaal 20 minuten, de combinatie van parameters is gevonden het meest doeltreffend voor het versnellen van klinische breuk reparatie ^6. De methode maakt gebruik van recombinante fibronectine fragmenten aan α ₅ β _1-integrine, gaan zonder engagement van syndecan-4, en vereist remming van de eiwitsynthese door cycloheximide tot afzetting van extra matrix te blokkeren door de fibroblasten., Het positieve effect of ultrageluid op herstelmechanismen is goed gedocumenteerd ^7,8, en door het begrijpen van de moleculaire werking van ultrageluid in de cultuur moeten we in staat zijn om de therapeutische techniek te verfijnen om de klinische resultaten te verbeteren.

Protocol

1. Coating Oppervlakken met Matrix Ligand

1. Ultrasound worden toegepast om cellen in 3,5 cm putten, als individuele schotels of een 6-wells plaat. Voor biochemische assays, jas ligand direct op het plastic. Voor immunofluorescentie, kook dekglaasjes drie keer in MilliQ water en plaats 4 dekglaasjes in de bodem van elk putje.
2. Glazen oppervlakken moeten gederivatiseerd efficiënte ligand coating garanderen. Los sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester in PBS met 1 mM. 2 ml in elk putje en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
3. Was de gederivatiseerd oppervlakken 3 maal met PBS.
4. Laag of gederivatiseerde glas of kunststof met onbehandelde integrine ligand. Breng 2 ml van 10 ug / ml integrine ligand9, opgelost in PBS met ^{Ca2 + en} Mg2 ⁺ in elk putje en incubeer overnacht bij 4 ° C.
5. Bereid monoparticulate BSA door verhitting 1% BSA, opgelost in PBS, tot 85 ° C gedurende 13 minuten. Toestaanafkoelen; passeren door een 0,45 pm-filter.
6. Was ligand gecoate oppervlakken 3 maal met PBS en blok met monoparticulate BSA voor 30 minuten.

2. Voorbereiding van de Cellen

1. Om de matrix milieu tijdens het experiment te controleren, eiwitsynthese geblokkeerd door toevoeging van 25 ug / ml cycloheximide 80% confluent fibroblasten 2 uur.
2. Spoel cycloheximide-behandelde cellen met PBS en los te maken van de cultuur fles met behulp van 0,5 mg / ml trypsine / EDTA.
3. Harvest vrijstaande cellen door centrifugeren bij 500x g gedurende 5 minuten.
4. Hersuspenderen cellen in DMEM/25 mM HEPES, 25 ug / ml cycloheximide.
5. Tel celdichtheid van de suspensie met een hemocytometer en verdun tot 105 ml-1.
6. Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 20 minuten oppervlakte integrine herstellen.
7. Spoel ligand beklede, BSA-geblokkeerde putjes drie keer met PBS.
8. Zaad 2 ml van de celsuspensie in elk putje.
9. Allow cellen gedurende 2 uur verdeeld bij 37 ° C, _5% CO2.

3. Echografie Stimulatie

1. Verwarm de ultrasone zender array en koppeling gel tot 37 ° C.
2. Breng een grootte van een erwt klodder gel koppelen aan elke zender.
3. Test dat elke zender functioneel is met behulp van een echo-indicator diode detector.
4. Plaats de putten op de zender array. Terug array 37 ° C, _5% CO2 en laat de temperatuur tot evenwicht 10 minuten.
5. Schakel de ultrasone signaal.
6. De ultrasone signaal uit te schakelen na 20 minuten, het nabootsen van de therapeutische regime. Als kortere tijden stimulatie vereist zijn, moet platen worden verwijderd uit de matrix op het juiste tijdstippen. In alle gevallen gebruik ongestimuleerde platen als negatieve controle.

4. Focal adhesion Analyse door Immunofluorescentie

1. Voor de analyse van focale adhesie vorming, gelden de 20-minuten echo-signaalen laat structuren een verdere 40 minuten ontwikkelen handhaven cellen bij 37 ° C, _5% CO2.
2. Zuig media en vast cellen door toepassing van 2 ml 4% paraformaldehyde in PBS. Incubeer gedurende 14 minuten bij kamertemperatuur.
3. Zuig paraformaldehyde en spoel drie keer met PBS, waarbij de PBS voorzichtig langs de rand van de put generatie afschuifkrachten te voorkomen.
4. Overdracht elk dekglaasje van de 3,5 cm en een 24-wells plaat voor latere immunofluorescentie kleuring.
5. Doof resterende paraformaldehyde door toepassing 0,5 ml 0,1 M glycine in PBS elk van de 24 putjes. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
6. Zuig glycine en spoel drie keer met PBS.
7. Permeabilise cellen door toepassing van 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
8. Zuig Triton X-100 en spoelen drie keer met PBS.
9. Blok door toepassing 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Incubeer overnacht bij 4 & dbv; C.
10. Stain vinculine-bevattende focal adhesion met hVIN-1 antilichaam verdund 1:400 in BSA blok. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur.
11. Spoel drie keer met PBS.
12. Breng fluorofoor (DyLight 488)-geconjugeerd secundair antilichaam (verdund 1:200) en de vlek actine met TRITC-geconjugeerde phalloidin (verdund 1:200) in BSA blok. Gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
13. Spoel drie keer met PBS, en een keer met water.
14. Monteer op een glasplaatje in een omgekeerde positie met behulp van Verleng Gold inbedmiddel.

5. Kwantificering van Rac1 Activering door Pull-down test

1. Voor analyse van Rac1 activering toepassen 20 minuten ultrasoon signaal cellen bij 37 ° C, _5% CO2. Bij de beoordeling responstijden langer dan 20 minuten, de ultrasone signaal op 20 minuten bij 37 cellen handhaven ° C, 5% _CO2 gedurende de resterende tijd om de reactie te ontwikkelen.
2. Zuig media en plaats goeds op ijs. Spoel putten met 2 ml koude PBS en aspiratie. Zorg ervoor dat alle resterende PBS wordt verwijderd door het verlaten van putten gekanteld gedurende 1 minuut, gevolgd door een grondige aspiratie.
3. Lyseren cellen op ijs en 35 ul lysisbuffer (10% glycerol, 20 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 x volledige protease inhibitor) per well. In dit voorbeeld worden 6 wells die per tijdstip 210 pi cellysaat genereren. Meer of minder uitsparingen kunnen worden gebruikt, maar totaal lysaat volume moet totale ~ 200 pi.
4. Schraap cellen grondig met celschraper om volledige cellysis te garanderen en putten laten kantelen gedurende 1 minuut, zodat lysaat te bundelen.
5. Overdracht lysaat een ijskoude 1,5-ml microfugebuis (pooling lysaten van dezelfde behandeling regime) en de spin op 21000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C tot pellet cellulaire puin.
6. Breng 180 ul van lysaat aan ijskoude 1,5-ml microfugebuisje buizen met 130 pl van lysis buffer en 25 pi PAK-glutathione agarose parels ^10. Houd resterende ruwe lysaat bij -20 ° C voor latere gel gescheiden.
7. Leg actief Rac1 op de PAK-glutathion agarose parels door het draaien van buizen gedurende 40 minuten bij 4 ° C.
8. Oogst agarose kraal conjugaten door centrifugatie bij 2000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
9. Was de kraal conjugaten drie keer met 500 ul lysis buffer, het oogsten van kralen door centrifugeren bij 2000 x g en de teruggooi supernatant na elke wasbeurt. Verwijder voorzichtig het resterende lysis wasbuffer met een 200 ul pipet.
10. Elueren elk monster door toevoeging 35 pl SDS-PAGE laadbuffer en incuberen bij 85 ° C op een schudden verwarmingsblok gedurende 5 minuten. Verwijder de kralen door centrifugatie bij 21.000 xg gedurende 1 minuut.
11. Los kraal eluaat door SDS-PAGE, overdracht naar nitrocellulose en peil Rac1.

6. Representatieve resultaten

In dit protocol beschrijven we de inductie van vinculine-vleked focale adhesies en Rac1 activiteit door echografie. Voor de focal hechting experiment de uitgangspositie dat fibroblasten uitgespreid op een ligand van α ₅ β ₁ integrine niet vinculine bevattende adhesies (Fig. 3A) vormen, tenzij een tweede fibronectine receptor, syndecan-4, die door toevoeging van oplosbare ligand (Fig. 3B) ^3,4. Echter, stimulatie met echografie induceert focal adhesion vorming in dezelfde mate als engagement van syndecan-4 (fig. 3C), wat aangeeft dat echografie stimulatie kan vervangen voor bepaalde onderdelen van de fibronectine-afhankelijke signaalweg ^5. De sleutel hindernis met dit protocol is het verwijderen van focal adhesion vorming in de afwezigheid van stimulerende middelen. Onvolledige remming van de eiwitsynthese door cycloheximide zal matrix depositie die voldoende is om de cellen te automatisch stimuleren. Overbevolking van de cellen kan ook leiden tot low-level focal adhesion FORMATIEn en een slechte reactie op echografie als overspraak tussen de cel-cel en cel-matrix contacten zullen bemoeilijken een experiment dat is ontworpen om een ​​stimulans te isoleren. Als een ontwikkeling van de basis assay tonen we hetzelfde experiment herhaald met fibroblasten ontbreekt syndecan-4 (Fig. 4). Deze fibroblasten nog steeds reageren op de echografie (fig. 4C), maar niet om te reageren op syndecan-4 ligand (Fig. 4B). Het experiment met behulp van Sdc4 - / - fibroblasten laat zien dat echografie inderdaad omzeilen de behoefte aan bepaalde fibronectine-receptoren, en illustreert hoe de eenvoudige protocol kan worden ontwikkeld om extra informatie over de signaalweg te krijgen.

Voor de biochemische experiment tonen we aan dat echografie kan de activering van Rac1 induceren, met behulp van een pull-down test, die een aanpassing van de methode beschreven door Del Pozo et al.. ^10. Precipitatie van actieve Rac1 0, 10, 30 en 60 minuten na inidifferentiatie van ultrageluid stimulatie blijkt dat Rac1 activiteit pieken op 10-30 minuten, voordat hij terugkeerde naar de basislijn (afb. 5). Blotting ruwe lysaten voor vinculine zorgt voor gelijkwaardige belasting tussen de tijdstippen. Het resultaat lijkt op activering van Rac1 door inschakeling van syndecan-4 ^3, maar is iets langduriger dan activering door fibronectine. Daarom 8-10 herhalingen normaal nodig is om significante gegevens plaatsvindt. Activering van Rac1 is verantwoordelijk voor de inzet van cellen om focale adhesie vorming en opkomende focale adhesies beginnen te vormen op 10-30 minuten, die samenviel met Rac1 activering. Eenmaal in gang wordt de adhesie verder groeien tot grote adhesie plaques de figuren 3 en 4.

Figuur 1. Echo golfvorm. Echografie bestaat uit een onderbroken 1,5 MHz signaal dat door de lage amplitude (30 mW / cm ^{2, ruimtelijke gemiddelde, temporele gemiddelde) heeft geen verwarming effect.}

Figuur 2. Schematische weergave van de workflow voor de voorbereiding en het stimuleren van de cellen met echografie.

Figuur 3. Ultrasound inductie van focale adhesie vorming in fibroblasten. Fibroblasten uitgestreken op de integrine-bindende fragment van fibronectine (A) voor stimulatie met syndecan-4-bindend fragment van fibronectine (B) of ultrasoon (C). Na 60 minuten stimulatie werden de cellen gefixeerd, gekleurd vinculine en actine, en afgebeeld op epifluorescente. Bar = 10 urn.

Figuur 4. Ultrasound inductie van focale adhesie vorming in fibroblasten ontbreekt syndecan-4. Sdc4 - / - fibroblasten uitgestreken op de integrine-bindende fragment van fibronectine (A) voor stimulatie met syndecan-4-bindend fragment van fibronectine (B) of ultrasoon (C). Na 60 minuten stimulatie werden de cellen gefixeerd, gekleurd vinculine en actine, en afgebeeld op epifluorescente. Hoewel Sdc4 - / - fibroblasten waren fibronectine-ongevoelig, echografie nog steeds veroorzaakt focal adhesion formatie, waaruit blijkt dat echografie omzeilt matrix receptor engagement. Bar = 10 urn.

Figuur 5. Activering van Rac1 door echografie. Cellen werden gestimuleerd 0, 10, 30 en 60 minuten met 6 putjes gebruikt per tijdstip. De hoeveelheid GTP-Rac1 in monsters uit een Rac1 pull-down assay tijdsverloop werd gevisualiseerd door incubatie met anti-Rac1 antilichaam op een Western blot (bovenste afbeelding). Kwantificering van de band intensiteit (gemiddelde van 8-10 herhalingen) blijkt verhoogd Rac1 eenctivity als gevolg van echo-signaal op 10 en 30 minuten, voordat hij terugkeerde naar de uitgangswaarden na 60 minuten (grafiek). Error bars geven sem

Discussie

In dit protocol beschrijven we de wijze waarop een behandeling die gewoonlijk wordt gebruikt voor humane patiënten kunnen worden gebruikt in cel-gebaseerde experimenten. Het uiteindelijke doel is om het moleculaire mechanisme van ultrasound actie te begrijpen, zodat de therapie kan worden verfijnd. In dit protocol gebruiken we muis embryonale fibroblasten (MEF) als een model mobiele systeem, maar echografie is ook gevonden effectief te zijn in primaire menselijke voorhuid fibroblasten ^5, mesenchymale stamcellen, osteoblasten en chondrocyten ^6. We gebruiken Rac1 activering voorbeeld biochemische assay, maar de werkwijze kan worden gebruikt zowel voor regeling van eiwitfosforylering of vorming van eiwit-complexen door immunoprecipitatie testen. Voor de immunofluorescentie voorbeeld tonen we een effect ultrageluid op focal adhesion vorming, maar herverdeling van elk molecuul kunnen worden onderzocht. Zo kon men de aanwerving van cytosolische factoren te toetsen aan de plasmamembraan, colocalisation van proteins in de handel blaasjes of onderzoeken van het effect van ultrageluid op mitotische spindel organisatie. Tot nu toe hebben we ons beperkt tot fibronectine afhankelijke trajecten testen door de werking van ultrageluid op cellen op collageen, of in aanwezigheid van groeifactoren kunnen worden getest het opbouwen van een beeld van ultrageluid invloed celgedrag in een complexe omgeving meer veel lijkt op een in vivo situatie. Een grotere uitdaging zal zijn om het effect van ultrageluid met behulp van time-lapse imaging, waar de aanwezigheid van de zender het lichtpad en trillingen het blokkeren van de echografie huidige aanvullende technische obstakels te testen. Echter, het feit dat de therapeutische toepassing op slechts 20 minuten van de stimulatie per dag in beslag suggereert dat analyse van cel gedrag na een uitbarsting van stimulatie kan ook productief te zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester	FisherPerbio	PN22312	25 mM bestanden in water opgelost worden opgeslagen bij -20 ° C
6-well weefselkweek plaat	Corning	3516	Plastic van andere bedrijven kan jas slecht
13-mm glas dekglaasje	Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS	MIC3336	Glas van andere bedrijven kan jas slecht
PBS	Sigma	D8537
PBS, Ca2 + Mg2 +	Sigma	D8662
50K integrine ligand (fibronectine fragment)	Construct beschrijving en prebereiding van 9, 11		Alternatief matrix liganden kunnen worden gebruikt om andere routes ondervragen
BSA	Sigma	A3059
Cycloheximide	Sigma	C7698	Kunnen worden opgeslagen als 10mg/ml voorraad in het water
DMEM/25 mM HEPES	Sigma	D6171
Exogene 4000 +	Smith & Nephew Inc
Echografie koppeling gel	Smith & Nephew Inc
SAFHS indicator	Smith & Nephew Inc
hVIN-1	Sigma	V9264
DyLight 488-geconjugeerd anti-muis	Stratech Wetenschappelijk	715-485-150
TRITC-gelabelde phalloidin	Sigma	P1951
Verleng Gold antifade reagens	Invitrogen	P36930
volledige protease-remmer (EDTA gratis)	Roche	056 489 001	100 × voorraad opgebouwd uit tablet bewaard bij -20 ° C
PAK-glutathion agarose parels	Construct beschrijving en de voorbereiding op de 10
Glycerol	Visser	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Maak 1M voorraad en pH tot 7,4
NaCl	Visser	S/0160/65
NP40	Sigma	I3021
Natriumdeoxycholaat	Sigma	D6750
EGTA	Sigma	E4378
EDTA	Sigma	E5134