Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Samenvatting

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Samenvatting

Recombinant eiwitexpressie in bacteriën, meestal E. coli, is de meest succesvolle strategie voor milligram hoeveelheid expressie van eiwitten. Echter prokaryotische gastheren vaak minder geschikt voor expressie van humane, virale of eukaryotische eiwitten door toxiciteit van buitenlandse macromolecuul, verschillen in de eiwitvouwing machine, of door het ontbreken van bepaalde co-of post-translationele modificaties in bacteriën. Expression systemen op basis van gist (P. pastoris of S. cerevisiae) ^1,2, baculovirus geïnfecteerde insecten (S. frugiperda of T. ni) cellen ^3, en celvrije in vitro vertaalsystemen ^2,4 zijn met succes gebruikt om de produceren zoogdiereiwitten. Intuïtief de beste overeenkomst is een warmbloedige gastheer gebruikt om de productie van recombinante eiwitten die de juiste post-translationele modificaties bevatten waarborgen. Een aantal zoogdierlijke cellijnen (humane embryonale Kidney (HEK) 293 zijn C V-1 cellen O rigin die de S V40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovarium (CHO), en anderen) succes gebruikt om milligram hoeveelheden van een aantal humane eiwitten tot overexpressie ^5-9. Echter de voordelen van zoogdiercellen vaak tegen hogere kosten vereist gespecialiseerde laboratoriumapparatuur lagere eiwitopbrengsten en lange tijd om stabiele cellijnen te ontwikkelen expressie. Het verhogen van de opbrengst en de productie van eiwitten sneller, terwijl de kosten laag zijn, zijn belangrijke factoren voor veel academische en commerciële laboratoria.

We beschrijven hier een tijd-en kosten-efficiënte, tweedelige procedure voor de expressie van uitgescheiden menselijke eiwitten van vreemde HEK 293T-cellen. Dit systeem is geschikt voor het produceren microgram tot milligram hoeveelheden van functionele eiwitten voor structurele, biofysische en biochemische studies. Het eerste deel, meerdere constructen van het gen van belang te producerend in parallel en tijdelijk getransfecteerd in adherente HEK 293T-cellen in kleine schaal. De detectie en analyse van recombinant eiwit uitgescheiden in het celkweekmedium wordt door western blot analyse in de handel verkrijgbare antilichamen gericht tegen een vector gecodeerd eiwit zuivering tag. Vervolgens worden geschikt constructen voor grootschalige productie van eiwitten transient getransfecteerd met polyethyleenimine (PEI) in 10 laag celfabrieken. Eiwitten uitgescheiden in liter-volumes van geconditioneerd medium zijn geconcentreerd in hanteerbare hoeveelheden met behulp van tangentiële flow filtratie, gevolgd door zuivering door anti-HA-affiniteitschromatografie. Het nut van dit platform wordt bewezen door het vermogen om milligram hoeveelheden cytokines, cytokine receptor celoppervlakreceptoren, intrinsieke beperking factoren en virale glycoproteïnen drukken. Deze methode is ook met succes gebruikt in de bepaling van de structurele trimere ebolavirus glycoproteïne ^5,10.

2 incubator, vereist. Deze procedure kan snel worden uitgebreid systeem van grotere complexiteit, zoals co-expressie van eiwitcomplexen, antigenen en antistoffen productie van virusachtige deeltjes voor vaccins of productie van adenovirussen of lentivirussen voor transductie van moeilijk cellijnen.

Protocol

1. Voorbereiding werk - constructen en celculturen

Voordat het protocol zou het gen van belang zijn codon geoptimaliseerd voor expressie in zoogdiercellen en gekloneerd in een geschikte expressievector gebruikmaking van standaard moleculair-biologische technieken. Om de hoogste kans op succesvolle expressie te garanderen, moet meerdere varianten van het gen van belang worden gegenereerd. Veel zoogdieren expressievectoren zijn in de handel verkrijgbaar en hebben verschillende zuivering tags (polyhistidine, hemagglutinine, streptavidine, HALO-Tag, glutathion S-transferase, onder anderen). Wij geven de voorkeur aan de pDISPLAY vector die codee....

Discussie

De 10 lagen celfabrieken een effectieve vat voor de productie van milligram hoeveelheden eiwit. Een belangrijk voordeel van de cel fabriek op andere traditionele vaartuigen zoals rolflessen, schudkolven of spinner kolven, is dat niet nodig de aanschaf van extra laboratoriumapparatuur. Een standaard CO ₂ incubator (~ 6,0 cu. Ft) zal gemakkelijk geschikt voor vier 10-layer cel als fabriek (afb. 2). Bovendien vereisen deze vaartuigen minder arbeid en ruimte dan schotels of rolflessen van cellen .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Alkalische fosfatase (BVIE / NBT) vloeibare substraatoplossing	Sigma	B6404
Antibiotica / Antimycoticum, 100X	Invitrogen	15240062
Anti-HA affiniteitsmatrix, kloon 3F10	Roche	1815016
Anti-HA muizen mAb, kloon 16B12	Covance	MMS-101P
Celkweekkolf, T75 cm 2 weefselkweek behandeld	Corning	430641
Celkweekkolf, T225 cm 2 weefselkweek behandeld	Corning	431082
Cell kweekplaten ,6-en weefselkweek behandeld	Corning	3516
De cel als fabriek, 10-laag CellStack	Corning	3312
Centramate Omega 5K Cassette	Lijkkleed	OS005C12
Centramate Omega 30K Cassette	Lijkkleed	OS030C12
Chromatografie glazen kolom, 1.0x10 cm	Kontes	4204001010
Ciprofloxacine	Sigma	17850
CO 2
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)	Sigma	D5796
Foetaal runderserum (FBS), warmte geïnactiveerd	Invitrogen	12484-028
FuGENE HD transfectiereagens	Promega	4709691001
GeneJuice transfectiereagens	EMD / Merck	70967-6
Glycine	Sigma	G8898
Geit anti-muis IgG F (ab ') 2 alkaline	Thermo Scientific	31324
fosfatase-geconjugeerd antilichaam
Hemagglutinine (HA) peptide, 100 mg	Genscript	Synthese op maat
(Volgorde: YPYDVPDYA; 95% zuiverheid)
HEK 293T-cellen	ATCC	CRL-11268
Household bleekmiddel (4% w / v natriumhypochloriet)	diverse merken zijn
Immobilon-P membraan PVDF	Millipore	IPVH07850
Miniprep plasmide zuiveringssamenstel, Purelink Quick	Invitrogen	K2100-11
MaxiPrep plasmide zuivering kit, Purelink HiPure	Invitrogen	K2100-07
NaN 3	Sigma	S8032
pDISPLAY expressievector	Invitrogen	V660-20
Penicilline / streptomycine (pen / strep), 100X	Invitrogen	15140-122
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), steriele 1X	Sigma	D8537
Polyethyleenimine (PEI), lineaire 25 kDa	Polyscience	23966
Magere melk droog poeder	Anjer
Stericup-GP PES vacuümfiltratie-eenheid,	Millipore	SCGPU05RE
0,22 pm, 500 ml
Trypaan blauw	Invitrogen	15250061
Trypsine-EDTA, 0,05% (w / v)	Invitrogen	25300-054
Tween-20	Sigma	P7949
Valproïnezuur	Sigma	P4543
Centramate tangentiële stroomsysteem	Lijkkleed
CO 2 bevochtigde incubator, standaard 6,0 cu. ft	diverse merken zijn
Elektroforese en overdrachteenheid	diverse merken zijn
Incubator, 37 ° C	diverse merken zijn