$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Coupes voor het ongekleurde secties
- Stel waterbad en microtoom als voor standaard paraffine coupes. Gebruik positief geladen dia's en pre-label met zaaknummer, pancreas regio (monster) en slide nummer. Plaats paraffineblok in de microtoom boorkop met de cassette label aan de linkerkant.
- Volgens de normale procedures coupes, sectie in blok tot weefsel wordt gelijkmatig aangetroffen. Maak een lint van seriële secties (4 micrometer dik, 3-6 afhankelijk van het aantal vereiste initiële vlekken (zie arrest van Submission Form, bijlage 1)). Aparte secties in het lint, pick-up iedereen moet nemen om, en leg ze op dia's met om genummerd met potlood. Noem als een deel niet wordt gebruikt door de nummering secties in precies dezelfde volgorde. Houd dezelfde richting op de dia zoals gevonden in de cassette met de dia-label gericht op de links. Droog nacht bij kamertemperatuur vervolgens door te gaan met vlekken of distributie aan onderzoekers.
- Respaling oppervlak paraffineblok met dunne laag paraffine weefsel en archief bewaren bij kamertemperatuur of 20 ° C.
- Voor de volgende coupes, onderhouden nummering voor seriële secties op elk niveau als hierboven. Verkrijgen een extra dia en vlekken door H & E dia per ~ 100 uM niveau in elk blok.
2. H & E kleuring
- Plaats dan de eerste seriële coupes dia uit elk blok in een dia rek in de eerste lade op de Autostainer.
- Selecteer de standaard H & E vlek programma en ga verder zoals gewoonlijk.
- Wanneer u klaar bent vlekken, verwijdert u de dia's van Autostainer en plaats in de kap voor afdekken.
- Dekglaasje met standaard technieken. Goed afdrogen en label met een gedrukt etiket (zie paragraaf 12).
3. IHC Set-up
- Selecteer de Dako-programma voor dubbele vlekken en input aantal dia's. Bereid TBST en citraat buffers, antilichamen, en Reagouders op basis van gespecificeerde volumes (tabel 1). Laad het reagens lade en dia's. Rotatie van schone en afval lijnen zijn geprogrammeerd conform de aanbevelingen van de fabrikant.
- Als het uitvoeren van deze testen handmatig, bereiden geschatte volumes. Incubeer dia's in een vochtige kamer om dia's uit bij elke stap het drogen te voorkomen. Volg dezelfde procedure voor alle reagentia als bij gebruik voor Autostainer.
4. IHC Deparaffinization en Antigen Retrieval
- Zet dia's in xyleen gedurende 5 minuten. Herhaal een keer. Zorg ervoor dat de dia's om uit te drogen op een later moment tot aan aangegeven, omdat dit zal resulteren in overmatige achtergrond en slechte kleuring.
- Breng dia's op 100% ethanol gedurende 2 minuten. Herhaal een keer.
- Slides in vers bereide 3% H 2 O 2 in methanol gedurende 10 minuten.
- Dip dia's in 90% ethanol en vervolgens plaatsen in 90% ethanol gedurende 3 minuten.
- Transfer schuift aan70% Ethanol gedurende 1 minuut.
- Spoel de objectglaasjes in gedeïoniseerd water.
- Verwarm de steamer en citraat buffer in stoompan gedurende 5 minuten.
- Voeg dia's om buffer citraat in de stoompan en stoom gedurende 30 minuten.
- Onmiddellijk overbrengen dia's om water te houden, tot de dia's afkoelen tot kamertemperatuur (~ 20 minuten).
- Zet dia's aan het Dako Autostainer racks op basis van volgorde (figuur 1) vlekken op en voer de dubbele kleuring programma. De belangrijkste stappen van het Autostainer programma zijn zo vermeld dat handmatige runs kunnen dupliceren.
5. Eerste Primaire antilichamen (Ki-67, CD3-, pancreas polypeptide)
- Blokkeer dia's met Sniper oplossing gedurende 15 minuten. Was twee keer met TBST.
- Incubeer dia's in primaire antilichaam gedurende 30 minuten. Was twee keer met TBST.
- Incuberen met Mach2 geit anti-muis (Ki-67) of anti-konijn (CD3, pancreas polypeptide) mierikswortelperoxidase (HRP) polymeer 30 minuten. Was twee keer met TBST.
- Breng 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) om dia's voor 4 minuten. Was twee keer met water.
- Dia geïncubeerd met pancreas polypeptide gehouden op Dako wanneer wordt gelijktijdig getest en TBST bij alle volgende stappen terwijl de overige dia worden geïncubeerd met de tweede primaire antilichamen. Als alternatief voor het handmatig testen, gaat u naar hoofdstuk 6.
6. Tweede Primaire antilichamen (insuline, glucagon)
- Incubeer dia's in Deeb gedurende 20 minuten. Was twee keer met TBST.
- Blok met 10% normaal geitenserum in 20% avidine blokker in TBST (insuline) of Sniper (glucagon) in TBST gedurende 20 minuten. Was twee keer met TBST.
- Incubeer met insuline of glucagon primaire antilichaam gedurende 15 minuten. Was twee keer met TBST.
- Insuline: Incubate dia's in gebiotinyleerd geit anti-cavia bij 1:300 verdunning gedurende 30 minuten. Was twee keer met TBST. Incubeer met standaard vector ABC-AP reagens voor 30 minuten. Was twee keer met TBST.
- Glucagon: incuberen dia in buffer gedurende 30 minuten gevolgd door geit anti-muis alkalische fosfatase (AP) polymeer gedurende 30 minuten. Was twee keer met TBST.
- Terwijl de dia's worden geïncubeerd in conjugaten, warmen de LPR-buffer op kamertemperatuur. Voeg 1 druppel vloeistof permanent rood (LPR) per 3 ml buffer direct voor het gebruik en de plaats in Dako reagens rek. Incubeer dia's in LPC gedurende 4 minuten. Was twee keer met water.
- Incubeer dia's in hematoxyline gedurende 1 minuut. Twee keer spoelen met water.
- Incubeer dia's in TBS pH 7,6 gedurende 1 minuut. Twee keer spoelen met water.
- Unload dia's van DAKO Autostainer.
- Onmiddellijk drogen dia's gekleurd voor pancreas polypeptide. Voor alle dubbele glas dia's, droog voor minstens 1 uur dan uitdrogen.
7. Uitdroging
- Plaats de glaasjes in 80% ethanol gedurende 1 minuut.
- Dompel dia's in 95% ethanol.
- Houd dia in 95% ethanol gedurende 30 seconden.
- Breng dia's op 100% ethanol en houd 1 minuut. Herhaal.
- Dip dia's in xyleen.
- Houd dia's in xyleen gedurende 1 minuut. Herhaal.
- Onmiddellijk monteren dekglaasjes op dia's met behulp van cytoseal.
8. Slide Labeling
- Geef de geval gebeurd de identificatie informatie, inclusief orgel en bloknummer, vlek, en de datum en print. Serial sectie nummer is optioneel voor de eerste dia vlekken van elk blok. Volgende niveaus worden aangeduid met nummering.
- Plaats etiketten op dia's.
9. Dia's scannen
- Plaats in lood dia's in de scanner lade en scannen op basis van instrumentatie.
- Organiseer dia's door donor en weefseltype (pancreas hoofd, lichaam, staart, de milt).
- Archief gebrandschilderde dia's bij kamertemperatuur en de resterende ongekleurde dia's bij -20 ° C tot gebruik.
10. Representative resultaten
Deze vlekken procedures werden ontwikkeld voor de JDRF Network for Pancreatic orgaandonoren met diabetes (nPOD) met de uitgangswaarde karakterisering van paraffine en vers bevroren blokken te bieden. Elke donor heeft een uitgangswaarde karakterisering uitgevoerd bestaat uit vlekken 2 blokken van elk alvleesklier regio (hoofd, lichaam en staart) en de milt (Figuur 1, zie ook zaak indienen vorm, bijlage 1). De H & E kleuring wordt uitgevoerd met behulp van een Autostainer geprogrammeerd als voor een klinische faciliteit met klinische-grade oplossingen gebruikt in. Als extra donor-blokken zijn coupes, elk heeft een glijbaan genomen voor H & E om weefsel morfologie te laten zien. Bij het blokken zijn weer coupes, als voor distributie naar de onderzoekers, zal diepere niveaus ook dia's genomen voor representatieve H & E dia's aan het hele blok van weefsel morfologie documenteren en nummering seriële secties op elk niveau. Stained dia's zijn voorzien vangeval gebeurd de identificatie, de alvleesklier regio, bloknummer, vlek en datum (figuur 2) en gescand in de online pathologie informatie management systeem. Representatieve beelden van een controle-donor zijn weergegeven in figuur 3 bij zowel lage als hoge vergrotingen te verwachte resultaten tonen deze procedure. De slede gekleurd met pancreas polypeptide (D, H) werd bepaald op een andere dag de assay uitgevoerd handmatig toont verminderde intensiteit van de kleuring hematoxyline tegenkleuring. Verschillen in kleuringsintensiteit primaire antilichamen of tegenkleuring tussen assays wordt vermeden vooral bij gebruik beeldanalyse anders glijdt met afzonderlijke kleurcorrectie dezelfde cel gebieden of tellingen te bereiken.
Elk laboratorium dient te verwachten dat de concentraties aan antistoffen te optimaliseren als lot-to-lot variatie en andere reagentia en voorwaarden kunnen vlekken intensiteit en specificiteit beïnvloeden. Met de aanschaf van nieuwe reaheren, zijn kleuringen gevalideerd met bekende positieve en negatieve controlemonsters in dezelfde mate van de vlek intensiteit te bereiken als met oud-reagentia. Extra antilichamen geoptimaliseerd in de pathologie nPOD kern worden in tabel 2 als referentie en zijn gebruikt voor multilabeling immunofluorescentie assays voor confocale microscopie.
Figuur 1. Dako vlekken net. Dit schema toont een routine-analyse van een nPOD donor alvleesklier uitgevoerd op een Dako Autostainer. De nPOD donoren zijn gecodeerd met een 4-cijferig identificatienummer. Twee dia's laden worden getoond met dia's, georganiseerd door vlek. Alternatieve slide configuraties worden verwacht, afhankelijk van het aantal donoren dia's. Positieve controles zijn onder andere opname van een bekende positieve donor voor de twee dubbele vlekken en donor milt voor Ki-67 en CD3. Negatieve controles is tweeledig en bestaat uit twee slides ene donoralvleesklier blok geïncubeerd met immunoglobuline (Ig) van de gastheersoort van de primaire antilichamen en twee dia's van donor milt voor insuline en glucagon.
Figuur 2. Vertegenwoordiger dubbel glas glijbaan. Een typische afgewerkte dia wordt weergegeven met glijbaan etikettering parameters en weefsel plaatsing voor digitaal scannen wordt uitgevoerd.
Figuur 3. Vertegenwoordiger van H & E en IHC vlekken in de pancreas secties. Artikelen uit de pancreas van een volwassen vrouwtje orgaandonor (6096-04 Panhead) waren gekleurd en digitale scans uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. Verkrijgt men beelden met het ImageScope die programma van de gehele sectie (AD) en van een eiland (EH). De verwachte eilandje vlek intensiteiten voor insuline, glucagon, en pancreas polypeptide zijnwaargenomen voor secties BD als sectie D schetst dat dit alvleesklier hoofd blok een klein deel van de uncinate regio of ventrale pancreas lob als alle eilandjes vooral de pancreas polypeptide-positieve cellen bevatten bevat. Merk op dat de hematoxyline tegenkleuring in het paneel D is te licht, terwijl de hematoxyline tegenkleuring intensiteiten in B-en C-optimaal zijn. Panelen EH tonen een eilandje van het dorsale lob met de verwachte verdeling van de β-cellen en α-cellen. Een paar pancreas polypeptide cellen worden aangetroffen in de linker deel van het eilandje (H). A, E-H &E; B, F-Ki67 + insuline, C, G-CD3 + Glucagon, D, H-pancreas polypeptide. AD, 0,2 x, EH-12.8x.