Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Samenvatting

Fluorescerende In situ Hybridisatie (FISH) om mRNA transcripten in individuele cellen te identificeren maakt analyse van polygene activiteit zoals de gelijktijdige transcriptie van meer dan een lid van de Var Multigenfamilie in Plasmodium falciparum Geïnfecteerde erythrocyten ¹. De techniek is aanpasbaar en kan gebruikt worden op verschillende genen, cellen en organismen.

Samenvatting

Hechting van Plasmodium falciparum geïnfecteerde erythrocyten (IE) om humane endotheliale receptoren tijdens malariabesmettingen wordt gemedieerd door expressie van PfEMP1 eiwitvarianten gecodeerd door de genen var.

De haploïde P. falciparum genoom herbergt ongeveer 60 verschillende var genen waarvan slechts een is verondersteld te transcriberen per cel tegelijk in het bloed stadium van de infectie. Hoe dergelijke elkaar uitsluitende regulatie van var gentranscriptie wordt bereikt is onduidelijk, evenals de identificatie van de individuele var genen of subgroepen van var genen geassocieerd met verschillende receptoren en het gevolg van differentiële bindend zijn voor de klinische uitkomst van P. falciparum infecties. Onlangs heeft de transcriptie elkaar uitsluitende paradigma is in twijfel getrokken door transcriptie assays gebaseerd op individuele P. falciparum transcript identificatie in enkele infected erytrocytaire cellen met behulp van RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) analyse van var gentranscriptie door de parasiet in individuele kernen van P. falciparum IE ^1.

Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van de RNA-FISH methode voor de analyse van var gentranscriptie in enkele kernen van P. falciparum geïnfecteerde humane erythrocyten. De methode is gebaseerd op het gebruik van digoxigenine en biotine-gelabelde antisense RNA probes met de TSA Plus Fluorescence Palette System ² (Perkin Elmer), microscopische analyse en vers geselecteerd P. falciparum IE. De in situ hybridisatie methode kan worden gebruikt om transcriptie en regulering van een aantal genen die tijdens de verschillende fasen van het P. toezicht falciparum levenscyclus en is aanpasbaar aan andere malariaparasiet soorten en andere organismen en celtypes.

Protocol

1. Generatie van Vers Geselecteerde geïnfecteerde erythrocyten

Voor deze test worden de beste resultaten verkregen met vers geselecteerde cultures voor oppervlakte-expressie van PfEMP1 eiwit. In dit experiment de 3D7 P. falciparum lineage is geselecteerd met specifieke antilichamen zoals eerder beschreven ^1.

Dag 1

1. Oogst 200 ul gepakte bloedcellen van een P. falciparum cultuur met 2-5% late stadium IE door centrifugeren bij 800 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur.
2. Het bloed pellet resuspendeer in 2 ml van 37 ° C warm 0,75% gelatine-oplossing in een 14 ml steriele buis en gedurende 15-20 min bij 37 ° C laat de geïnfecteerde en ring-stadium IE het sediment mogelijk.
3. Oogst de late-fase IE, dwz de bovenste fase, in een nieuwe 14 ml tube en was tweemaal met 10 ml van 37 ° C warm RBC-wash media.
4. Verdun 50 pi specifieke anti-PfEMP1-antilichamen in 2 ml van 37 ° C warm RBC-wasmedia en steriele filter.
5. Meng de gewassen laat stadium IE met het gesteriliseerde verdunde antisera in een 14 ml steriele buis en incubeer 30 min bij 37 ° C onder zacht schudden.
6. Spin down bij 800 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur, en was tweemaal met 10 ml van 37 ° C warm RBC-wasmedia.
7. Wassen 50 ul Proteïne A Dynabead suspensie tweemaal met RBC-wasmedia met een DynaMaq-15 magneet.
8. Resuspendeer de Dynabeads in 300 ul RBC-wash media en voeg ze toe aan de gewassen in een laat stadium IE. Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C onder zacht schudden.
9. Breng de buis aan de DynaMaq-15 magneet. Laat gedurende 1-2 minuten en verwijder al het vocht.
10. Resuspendeer de Dynabeads in 4-5 ml RBC-wash media. Breng de buis terug naar de magneet en laat het 1-2 min voor het verwijderen van alle vloeistof. Herhaal deze wasstap.
11. Breng de gewassen kralen aan een 25 cm ² steriele cultuur fLask met 200 ul vers verpakte rode bloedcellen. Voeg 5 tot 6 ml Albumax media in de cultuur. Bewaar nacht bij _5% CO2 bij 37 ° C.

Dag 2

12. Verwijder de Dynabeads uit de cultuur als de geselecteerde IE heeft het verse rode bloedcellen reinvaded door al de cultuur om een ​​14 ml steriele buis. Zet de tube op de DynaMaq-15 magneet en laat 1-2 minuten. Vervolgens giet al het vocht terug naar een cultuur kolf.
13. Cultuur voor zo weinig cycli als mogelijk tot een parasitemie van 5-10% en parasieten zijn bij de ringstage.
14. IE moet worden geanalyseerd door FACS om ervoor te zorgen dat de juiste oppervlakte fenotype, dat wil zeggen eiwitexpressie van een van beide PFD1235w and/orPF11_0008 is ^een verkregen.

2. Bereiding van Probes

De antisense RNA probes werden gegenereerd uit de variabele gebieden van de PFD1235w en PF11_0008 var </ Em> genen van P. falciparum 3D7 genomisch DNA. DNA werd geamplificeerd door PCR en gekloneerd in de vector pSPT18 of 19 voor transcriptie, respectievelijk volgens de door de fabrikant (Roche). De probes (580 baseparen (bp) en 590 bp in lengte) worden gemerkt met digoxigenine (DIG) of biotine met een DIG RNA labeling Kit of Biotin RNA labeling Mix respectievelijk. We bevestigden de specificiteit van de probes zowel Northern blot analyses en enkelvoudige FISH analyse ^1.

3. Dunne Smear en fixatie van parasieten Voorafgaand aan in situ hybridisatie

Dag 1

Alle stappen worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving en de reagentia RNase-vrij of voorbehandeld met diethylpyrocarbonaat (DEPC) of RNase Zap (Invitrogen). De dia's en dekglaasjes moet worden gereinigd met alcohol om de resterende productie-vet te verwijderen. Het is belangrijk om het protocol te voeren zonder pauze tussen de stappenom het risico van verontreiniging te minimaliseren nuclease.

1. Maak een dunne bloed film van de standaard verspreiden methode ^3. Met behulp van de 100x olie objectief van de microscoop, de telling van de IE en bereken het percentage van IE in de cultuur. Controleer of de parasiet stadia zijn bij benadering synchroon in de ring en vroege stadia van de trofozoiet IE cyclus. Dit zijn de pre-replicatie, uni-kiemen fasen expressie var gen mRNA en geschikt voor cel transcriptie FISH assays van dit type.
2. Breng 50 pl van de parasiet cultuur op parasitemie van 5-10%, met een 1,5 ml RNase-vrij Eppendorf buis. Centrifugeer gedurende 1 min bij 2.000 rpm bij kamertemperatuur.
3. Verwijder de media en voeg 50 ul PBS pH 7,2 in DEPC-behandeld water. Voorzichtig Schud de buis. Tweemaal herhalen centrifugale sedimentatie stap om de cellen vrij van media en celresten wassen.
4. Maak vier goede kwaliteit dunne strepen. Voor elke uitstrijkje, maak een uitstrijkje opeen diameter van 11 mm en een 4 goed glijbaan, dat wil zeggen vier glazen dia's in totaal, in een RNase-vrij kap (een kritische stap). Golf glijdt kort in de lucht te drogen. Maak drie extra geleiders voor negatieve controles een dia-sonde kleuring voor andere irrelevante gen met een bepaalde probe, een glijbaan voor RNase behandeling en een derde dia met IE niet het gen van belang. Laat de dia's om op de bank te drogen gedurende 10-20 minuten.
5. Bevestig de dunne films door 60 pi fixatie oplossing die 4% paraformaldehyde en 5% ijsazijn in de putjes. Laat 10 min op de bank bij kamertemperatuur.
6. Was de dia's in 2x SSPE buffer gedurende 5 min door voorzichtig schudden bij kamertemperatuur. Kort te verwijderen overtollige vloeistof door het aanraken van de putjes die de cellen voorzichtig met een papieren zakdoek.
7. Bedek de slides met 0,01% pepsine in 0,01 M HCl gedurende 2 minuten bij 37 ° C (een kritieke stap). Was de dia's in 2x SSPE gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
8. Verdun de RNase oplossing tot een eindconcentratie van 10 ug / ml. Het negatieve controle uitstrijkjes met 60 ul van de RNase oplossing. Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C en vervolgens het wassen van de objectglaasjes in 2x SSPE gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
9. Zich onmiddellijk de hybridisatiestap.

4. Hybridisatie van RNA probes aan de gefixeerde glaasjes

Dag 1

1. Bereid de hybridisatie kamer, zoals een ThermoStar 100 HC4 of een lege pipet tip box in een schone oven, door te besproeien met RNase Zap en af ​​te vegen schoon met een papieren zakdoek. Vul de kanalen van de hybridisatie kamer of de bodem van de doos met DEPC behandeld water te zorgen dat de dia niet uitdrogen tijdens hybridisatie. Sluit de tank af en verwarm tot 48 ° C.
2. Verdun de probes in de hybridisatie-oplossing tot een eindconcentratie van 12 ng / pl. Denaturatie van de probe-oplossing bij 65 ° C gedurende 5 min in een verwarmingsblok. Onmiddellijk koelen op ijs.
3. Kort aan de lucht drogen de dia's na de 2x SSPE wassen. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof rond de putten met een papieren zakdoek.
4. Open de hybridisatie kamer en plaats de dia's in de kamer. Een of beide probes in een totaal volume van 60 ul per putje. Voorzichtig dekking van de vloeistof druppel met een RNase-vrij dekglas met behulp van steriele pincet.
5. Sluit de tank en de dia hybridiseren bij 48 ° C gedurende ten minste 16 uur 's nachts.

5. Antilichaam Vervoeging en Fluorescentie Amplification

Dag 2

De volgende stappen zijn gebaseerd op de TSA Plus System Fluorescence Palette van Perkin Elmer. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

1. Was de dia 3 keer in TNT buffer gedurende 5 minuten onder zacht schudden.
2. Blokkeren putjes in 150 ul TNB buffer gedurende 30 min.
3. Verdun het HRP-geconjugeerd α-DIG antilichaam in TNB buffer bij een verhouding van 1:100 en het HRP-geconjugeerd α-biotine antilichaam in TNB buffer, in een verhouding van 1:500. Verwijder overtollig TNB buffer van de dia's met een papieren zakdoek. Bij het detecteren van gelijktijdig twee transcripten, kunnen beide antilichamen meteen gaan. Breng een totale hoeveelheid van 100 ui van het antilichaam-TNB oplossing per putje en zorgvuldig bedekken met een dekglas. Incubeer de glaasjes gedurende 2 uur.
4. Verwijder de dekglaasjes. Was de dia's in TNT buffer 3 keer gedurende 5 minuten.
5. Verdunnen FITC-fluorofoor in de tyramide versterkingsreagens in een verhouding van 1:500 en breng 100 ui van de oplossing aan elk putje. Bedek de putten met dekglaasjes en incubeer gedurende 12 minuten.
6. Verwijder de dekglaasjes en was de dia's 3 keer gedurende 5 minuten in TNT buffer door voorzichtig schudden.
7. Verdunnen Cyan3-fluorofoor in de tyramide versterkingsreagens in een verhouding van 1:500. Voeg 100 pl peren van deze oplossing. Bedek de putten met dekglaasjes en incubeer gedurende 12 minuten.
8. Verwijder het deksel glijdt zorgvuldig en vervolgens snel spoel de glaasjes door onderdompeling in TNT buffer.
9. Was de dia 3 keer met TNT buffer gedurende 5 minuten.
10. Quickly dompel de dia's in DEPC-behandeld water.
11. Laat de dia's aan de lucht drogen. Monteer de dia's met anti-fade reagens dat DAPI. Sluit de hoeken van de dekglaasjes met nagellak.
12. De dia's zijn nu klaar voor microscopie. Houd de glaasjes afgedekt met aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C indien het experiment moet worden ingevuld de volgende dag. Een volledige afdichting van de zijden van de schuiven kan worden uitgevoerd 24 uur na het aanbrengen van de anti-fade reagens. Hierdoor kan de dia te beelden tot een week na de protocol is voltooid.

6. Visualisatie van gehybridiseerd Probes

1. Zet de microscoop. Een standaard immunofluorescentie microscoop is sufficient voor dit soort experiment, maar als je toegang hebt tot een confocale microscoop kunt u ook gebruiken voor 3D-beelden of om video's van je gekleurde cellen te verkrijgen. Laat microscoop op te warmen voor 15-30 min. Schakel de computer en de software.
2. De kwaliteit van de vlekken op de immunofluorescentie microscoop. Kies een plek met een paar parasieten.
3. Handmatig de winst van elke laser. Stel de pixelverblijftijd van 4-6 m ^-1 s ^-1 en de stappen tot 512 x 512 pixels.
4. Neem een ​​testfoto met behulp van Frame Lambda. Stel de laser te krijgen.
5. Neem een ​​minimum van 20 goede foto's van fluorescerende enkele cellen. Tenminste 2-5 beelden van een veld met 5-20 parasieten nodig zijn een waarheidsgetrouw overzicht van het percentage positieve parasieten verkrijgen.

Resultaten

Figuur 1 toont een stroomschema van de belangrijkste stappen en de tijdsduur van de RNA FISH methode.

Een reeks van representatieve beelden van goed en slecht bewaard gebleven gebrandschilderde mRNA FISH experimenten met behulp van enkele P. falciparum IE worden getoond in Figuur 2. Deze intracellulaire protozoaire heeft een klein (1-1,5 micrometer diameter) kern, die is blauw gekleurd met DAPI. Vierentwintig uur na erytrocyten invasie in P. fal...

Discussie

RNA FISH analyse, in tegenstelling tot werkwijzen zoals Northern blotting en RT-PCR, maakt onderscheid specifieke mRNA transcripten in de enkele cel. Dit maakt het mogelijk onderscheid te maken tussen transcriptioneel actieve en inactieve cellen, in dit voorbeeld, P. falciparum parasitaire protozoa in menselijke rode bloedcellen. Dergelijke whole-cell waarnemingen zijn vaak nodig en kunnen ontrafelen belangrijke en nieuwe transcriptionele patronen ^1.

Hoewel andere RNA FIS...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Azijnzuur	Sigma / Aldrich	338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine oplossing	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml oplossing glutamine
Albumax media: gentamicinesulfaat Albumax-oplossing	Lonza	BE02-012E	2,5 ml gentamicinesulfaat 50 ml Albumax-oplossing
Albumax-oplossing: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g Hypoxanthine
Albumax-oplossing: AlbuMAX II	Iknvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-oplossing: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 liter RPMI 1640 Los met magneet bij max. 50 ° C. Filter steriliseer en bewaar bij -20 ° C in porties.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Hars formamide deioniseren.
Anti-biotine geit pAb peroxidaseconjugaat	Calbiochem	203206
Anti-DIG antistof	Novus Biologicals	NB100-41330
Anti-fade reagens met DAPI	Invitrogen	P36931	De fixeermiddelen moet gedurende 24 uur uitharden voordat de dia volledig afdichten.
Biotine RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Camera digitale	Nikon digitale zicht DC-F11
Dekglaasjes	Menzel-Glaser	631-1570
cultuur fles 25 cm 2 Nunclon oppervlak	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Voeg een roerstaaf en roer gedurende 12 uur. Autoclaaf gedurende 30 minuten.
Digitale camera	Nikon digitale zicht DC-F11
Proteïne A Dynabeads	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magneet	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Gedeïoniseerd formamide: 5 g ionenwisselaar per 100 ml formamide. Roer 30 min. Filtreer over Whatman papier.
. Gelatine 0 75% oplossing: Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Verwarm tot 56 ° C op te lossen. Filter steriliseren wanneer 56 ° C. Bewaren bij -20 ° C in porties.
. Gelatine 0 75% oplossing: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Verwarm tot 56 ° C op te lossen. Filter steriliseren wanneer 56 ° C. Bewaren bij -20 ° C in porties.
Glutamine oplossing: L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L glutamine in 500 ml 0,9% NaCl. Los, filter sterilize en bewaar bij -20 ° C in porties.
Glutamine oplossing: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L glutamine in 500 ml 0,9% NaCl. Los, filteren steriliseer en bewaar bij -20 ° C in porties.
Hybridisatie-oplossing: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Totaal 20 ml, blijven bevroren bij -20 ° C in porties 10 ml gedeïoniseerd formamide
Hybridisatieoplossing: 50x Denhardt's concentraat	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Hybridisatieoplossing: Gist tRNARoche blokkerend reagens	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt's 250 pl 20 mg per ml gist tRNA
hybridisatie-oplossing: zalmsperma DNA	Fluka / Sigma	31149-106GF	0.4g Roche blokkerend reagens 1 ml van 10 mg per ml zalmsperma DNA (Critical: denatureren zalm spermDNA bij 96 ° C gedurende 5 min voor het toevoegen aan de hybridisatieoplossing)
Veredelaar ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Kan vervangen worden door hybridisatie oven en RNase vrij hybridisatie kamers opgevuld met DEPC water.
Immersie-olie UV transparant fluorescentie gratis	Sigma	10976-1EA
Immunofluorescentie of confocale microscoop	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nagellak	Verkrijgbaar in elke drogist
20x PBS: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2PO 4 DEPC gedeïoniseerd H 2 O			Ajust pH tot 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4%	Fluka / Chemika	76240	4 g PFA in 80 ml PBS / DEPC. Verwarm tot 65 ° C totdat de PFA oplost. Voeg 20 ml PBS, laat de oplossing afkoelen. Breng de pH op 7,4. Filter. Store in aliquots bij -20 ° C.
Paraformaldehyde 4% / Acid azijnzuur 5%			950 ul paraformaldhyde + 50 pl Azijnzuur
Pepsine	Sigma / Aldrich	P7000
Peroxidase-geconjugeerd anti-biotine	Calbiochem	203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine oplossing	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml oplossing glutamine
RBC-wash media: gentamycinesulfaat	Lonza	BE02-012E	2,5 ml gentamicinesulfaat
RNase	Sigma / Aldrich		Een 10 mg / ml voorraadoplossing.
RNase vrij 1,5 ml tube	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Slides 4 putten 11mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 Na3 citraat x H 2 O (88 g / l) pH 7,0 met 1 M HCl
SSC 20x: Natriumcitraat uitdrogen	Sigma / Aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 Na3 citraat x H 2 O (88 g / l) pH 7,0 met 1 M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g NaH 2PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA poeder			9,4 g EDTA poeder Voeg DEPC water toe, breng de pH 7,4. Autokliefde gedurende 20 min
TNB buffer: TNT buffer			10 ml TNT buffer
TNB buffer: Het blokkeren van reagens			0,05 g blokkerend reagens Om het blokkerend reagens ontbinden Verwarm de oplossing tot 60 ° C gedurende een uur onder roeren. Bewaren bij -20 ° C. (Afgeleid van de Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris / HCl	Sigma	T1503	1M Tris / HCl, pH 8,0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Breng de pH op 7,5 bij kamertemperatuur. (Afgeleid van de Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3 / fluoresceïne-systeem	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Lees aandachtig het protocol van de TSA Plus Fluorescentie Palet systeem voordat het experiment.
Buizen 14 ml steriel	Almeco - CM LAB Aps	91016