Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

Samenvatting

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik van In vitro Methoden voor het bestuderen van migratie, zelfvernieuwing en multipotent van de neurale lijst.

Samenvatting

De embryonale neurale lijst (NC) is een multipotente voorlopercellen bevolking die afkomstig zijn van de dorsale aspect van de neurale buis, ondergaat een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) en migreert in het embryo, die aanleiding geven tot verschillende celtypen ^1-3. NC heeft ook de unieke mogelijkheid om de differentiatie en rijping van de doelorganen ^4-6 te beïnvloeden. Wanneer geëxplanteerd in vitro, NC voorouders zelfvernieuwing ondergaan, migreren en differentiëren in een verscheidenheid van het weefsel vormen, met inbegrip neuronen, glia, gladde spiercellen, kraakbeen en bot.

NC multipotent werd voor het eerst beschreven vanuit explantaten van de aviaire neurale buis ^7-9. In vitro isolatie van NC cellen vergemakkelijkt de studie van de NC-dynamiek met inbegrip van proliferatie, migratie en multipotent. Verdere werkzaamheden in de vogelgriep en ratten hebben aangetoond dat geëxplanteerd NC cellen hun NC potentieel behouden wanneer weer getransplanteerd in het embryo ¹⁰-13. Omdat deze inherente cellulaire eigenschappen zijn bewaard gebleven in geëxplanteerd NC voorouders, de neurale buis explant test biedt een aantrekkelijke optie voor het bestuderen van de NC in vitro.

Om een ​​beter begrip van de zoogdieren NC te realiseren, hebben vele methoden zijn gebruikt om NC bevolking te isoleren. NC-afgeleide voorlopercellen kan gekweekt worden uit post-trekkende locaties in zowel het embryo en volwassenen om de dynamiek van de post-trekkende NC voorouders ^11,14-20 te bestuderen, maar de isolatie van NC voorouders als ze emigreren van de neurale buis zorgt voor een optimale bewaring van NC cel potentieel en trekkende eigenschappen ^13,21,22. Sommige protocollen gebruiken fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) een NC populatie verrijkt bijzonder voorlopers ^11,13,14,17 isoleren. Echter, bij de start met een vroeg stadium embryo's celaantallen geschikt voor analyse moeilijk te verkrijgen met FACS bemoeilijkt de isolatie van de eerste NC populations van individuele embryo's. Hier beschrijven we een benadering die niet op de FACS en de resultaten vertrouwen in een ongeveer 96% zuiver NC bevolking op basis van een Wnt1-Cre geactiveerde lijn reporter ^23.

De methode hier gepresenteerde is een bewerking van protocollen geoptimaliseerd voor de cultuur van de rat NC ^11,13. De voordelen van dit protocol dan eerdere methoden zijn dat 1) de cellen niet gekweekt op een voedingsbodem, 2) FACS is niet vereist om een ​​relatief zuivere NC populatie, 3 verkrijgen) premigratory NC cellen geïsoleerd en 4) verloopt gemakkelijk worden gekwantificeerd. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt voor de isolatie van NC van een mutant muismodel de studie van het NC eigenschappen met verschillende genetische manipulaties. De beperking van deze benadering is dat de NC wordt verwijderd uit de context van de embryo, waarvan bekend is dat de overleving migratie en differentiatie van de NC ^2,24-28 beïnvloeden.

Protocol

1. Voorbereiding van Platen

1. Gebruik steriele techniek allen tijde.
2. Bereid fibronectine (FN) door verdunning 100 pl van menselijk plasma FN bouillon in een eindvolume van 3,3 ml in PBS van Dulbecco (DPBS). Uiteindelijke concentratie 30 pg / ml en kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 week.
3. Bedek bodem van elk putje van een steriele weefselkweek vier goed plaat met FN-oplossing en laten zitten voor 15 minuten. Zorg ervoor dat het hele oppervlak is bedekt. Merk media tijdens deze periode (stap 2 en 3).
4. Verwijder FN oplossing en laat platen drogen. Voorzichtig spoelen putten met 500 pL DMEM, verwijderen DMEM, en voeg 500 ul van Self-Renewal (SR) medium (zie hieronder). Incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5 procent _CO2. Vul dit ongeveer een uur vóór versnijding, zodat de platen droog voor gebruik.

2. Voorbereiden SR Medium

1. Voor de cultuur van de vagale en romp NCvan tien embryo (ongeveer een nest, afhankelijk genetische achtergrond van de muis lijn), bereid 25 ml SR medium. Meng 12,5 ml laag glucose DMEM, 7,5 ml Neurobasal Medium 25 pi retinoïnezuur (117 uM eindconcentratie) en 25 pi 2-mercaptoethanol (50 mM eindconcentratie). Meng goed.
2. Voeg 3,75 ml Chick Embryo Extract, 250 ul N ₂ extra zout, 500 pL B27 supplement en 250 ul penicilline-streptomycine (1% eindconcentratie). Filter het medium door een 0,22 pm filter.
3. Voeg 10 ul steriel IGF1 (20 ug / ml eindconcentratie) en 20 pi steriel bFGF (20 ug / ml eindconcentratie). Meng door het omkeren. Bewaar bij 4 ° C.

3. Voorbereiden Wash Medium

1. Voor ongeveer 10 embryo's voor te bereiden 50 ml wassen medium. Combineer 50 mg BSA met 35 ml lage glucose DMEM, 15 ml Neurobasal Medium, en 500 ul penicilline-streptomycine (1% eindconcentratie). Steriel filter met een 0,22urn gefiltreerd.

4. Voorbereiden Collagenase / Dispase

1. Voeg 50 pi van 100 mg / ml collagenase / Dispase tot 5 ml DPBS. Meng goed.
2. Spuit filter met een 0,2 um filter en 1,5 ml toe te voegen in elk van de drie putten van een twaalf goed plaat. Pipetteer ongeveer 1 ml wasmedium in de overige wells. Bewaar gehele plaat op ijs totdat u ze gaat ontleed weefsel verteren.
3. Snijd tips van een P20 en P1000 pipet filtertip met een steriel scheermesje. Juist onder de schuine rand van de tip. De afgesneden P1000 worden gebruikt om de gehele embryo dragen terwijl de p20 wordt gebruikt om stukjes geïsoleerde weefsel te brengen.

5. Isoleren Vagale en Trunk Neural Tube van 9,5 dpc embryo's

1. Voor de timing van zwangerschappen, worden dammen met een vaginale plug beschouwd 0,5 dpc 's middags' s ochtends de stekker wordt waargenomen. Offer en verwijder de baarmoeder van 9,5 dpc.
2. Verwijder de decidua van baarmoeder en voorzichtig rchrap het embryo uit de decidua. Na ervaring met dit protocol, te isoleren 3-4 9.5 dpc embryo's op een moment in een steriele DPBS. Gebruik steriele techniek en gesteriliseerd dissectie-instrumenten. Instrumenten kunnen worden gesteriliseerd door autoclaveren, warmte sterilisatie of door incubatie in ethanol.
3. Voor anterior vagale NC: het gebruik van insuline naalden, snijd de neurale buis in het midden otic placode. Snijd weer op de achterste rand van het 4 ^e somiet. Trim weefsel ventraal van de neurale buis om de faryngeale bogen en het hart te verwijderen.
4. Voor de romp NC: het gebruik van insuline naalden, verwijder dan het gedeelte van de neurale buis tussen somieten 16 tot 22 (of de laatste somiet als embryo's op ontwikkelingsgebied ouder zijn dan de 22 somiet stadium).
5. Houd de dooierzak en de eventuele resterende embryonaal weefsel voor genotypering.

6. Verwijdering van niet-neurale ectoderm en mesoderm

1. Plaats neurale buis met segmenten in collagenase / Dispase bij kamertemperatuur 10 minutens. Onmiddellijk in het wassen medium.
2. Keer terug weefsel tot steriele DPBS. Met behulp van steriele naalden insuline, verwijder voorzichtig de niet-neurale ectoderm uit het weefsel en scheid de somieten uit de buurt van de neurale buis. De laatste resterende delen van het mesoderm van somiet weefsel kan worden verwijderd door tritureren zachtjes met een cut-down P20 tip. Wees voorzichtig om geen schade aan de neurale buis. Observeer dit tijdens tritureren.
3. Plaats de geïsoleerde neurale buis door een tweede en derde 30 seconden wassen van het wasgoed medium.
4. Was eenmaal in SR medium, en plaats de geïsoleerde neurale buis in het midden van een FN-coating goed, dat eerder werd bereid (Stap 1.3). Dompel de hypoxie kamer met een schotel van steriel water. Plaats de schaal in de kamer hypoxie en spoel kamer met gasmengsel tot 3% O ₂ (met een tank met een mengsel van 1% O _{2, 6%} CO2, 93% _N2).
5. Ga altijd voorzichtig de kamer zeer zorgvuldig to tha zorgent explantaten geen storingen zijn en in het midden van de putten.
6. Incuberen bij 37 ° C. Samenvatting van de stappen 5-6 is weergegeven in figuur 1.

7. Verwijdering van de neurale buis

1. Na 24 uur incubatie, verwijder de neurale buis door voorzichtig plagen de rand van de neurale buis uit de buurt van de migrerende cellen met behulp van een steriele naald insuline. Verwijder de neurale buis van het medium met een steriele p20 gesneden als in stap 6.2 en vervangen door het medium met vers SR medium (figuur 2). Dit wordt het gemakkelijkst uitgevoerd met een omgekeerde microscoop.

8. Representatieve resultaten

Na 24 uur incubatie bij 37 ° C in hypoxische omstandigheden NC cellen gemigreerd van de neurale buis in een nagenoeg zuivere populatie (figuur 3a). Soms zal minder dan ideale culturen niet leveren robuuste uitwassen. Zo is het mogelijk dat na 24 uur tHij neurale buis zal hebben opgerold op zichzelf en het NC zal niet weg te stappen van de neurale buis (figuur 3b). Af en toe de neurale buis niet zal hechten aan de fibronectine gecoate platen.

In onze ervaring, kunnen sub-optimale NC migratie of problemen met de bevestiging van de neurale buis nadelig beïnvloed worden door normoxia voorwaarden of concentratie van de fibronectine, respectievelijk. Enzymatische activiteit van de collagenase / Dispase verschilt enigszins per partij en de spijsvertering tijd moeten behoren afgesteld, echter niet verteren het weefsel langer dan vijftien minuten. Overdigestion van de neurale buis die weefsel in collagenase / Dispase zal ook leiden tot een onvoldoende uitwassen. Als somiet weefsel wordt niet gemakkelijk uit de neurale buis na incubatie in collagenase / Dispase, kan de neurale buis worden geïncubeerd langer dan tien minuten. Soms neurale buis niet aan op het substraat. Indien dit het geval is, controleert de fibronectin concentratie en de hypoxia.

Hoewel normoxie kan worden cultuur wild-type NC, hypoxische omstandigheden nauwer na te bootsen de in vivo omgeving ^29,30. Onze ervaring is dat hypoxische condities werd kritisch bij het kweken van mutant NC. Wanneer bijvoorbeeld Foxd3 mutant NC werden gekweekt in normoxie, romp NC had een sterk verminderde cel uitgroei in vergelijking met controles. Dit verschil in grootte uitgroei werd verwijderd toen de explantaten werden gekweekt in hypoxische omstandigheden (figuur 4). Bovendien, als wild-type neurale buis explantaten werden gekweekt in normoxia het aantal caspase-positieve cellen was groter dan die van soortgelijke explantaten gekweekt in hypoxie (gegevens niet getoond). Door het handhaven van alle NC cultuur in hypoxie, kunnen vergelijkingen gemakkelijker worden gemaakt tussen de dynamiek van controle en mutant culturen.

Figuur 1. In het algemeen schema van NC-isolatie. A) Prepareer gebieden van interesse van het embryo. B) Digest neurale buis in collagenase / Dispase tien minuten (niet meer dan vijftien minuten). C) Was in wassen medium. D) Prepareer weg van de niet-neurale ectoderm en mesoderm. EF) twee keer wassen in wassen medium. G) Plate bij zelfvernieuwing medium. Incuberen bij 37 ° C in 3% O ₂ hypoxische omstandigheden.

Figuur 2. Stapsgewijze het verwijderen van de neurale buis van explantaat. De neurale buis moet worden verwijderd na 24-48 uur om verontreiniging met niet-NC-cellen te voorkomen. A) Let op de grens tussen de neurale buis en de NC uitgroei (vaste lijn). B) Knip langs de rand van de neurale buis met een insuline naald. C) Gooi de neurale buis en vervang medium met vers zelfvernieuwing medium. Onderbroken lijn geeft de omvang van de uitgroei. Afkorting: NT, neurale buis.

Figuur 3. Voorbeelden van representatieve resultaten. A) Typische explant uitgroei na 24 uur incubatie bij zelfvernieuwing medium in hypoxische omstandigheden (gestippelde lijn geeft de omvang van de uitgroei). B) Vergrote weergave van NC uitgroei na 48 uur in de cultuur. C) Minder ideale cultuur met een lage uitgroei opbrengst. A en C werden onder dezelfde omstandigheden. Afbeeldingen tonen het natuurlijke verspreidingsgebied in de cultuur robuustheid. Dit kan worden beïnvloed door de efficiëntie van de neurale buis isolatie, concentratie van het FN, hypoxische omstandigheden, en tijd in collagenase / Dispase ontsluitingen.

Figuur 4. In vitro analyses van NC explant culturen in normoxia ten opzichte van hypoxie. Control (wild-type) NC-cellen gemigreerd van neurale buis explantaten na 48 uur in normoxische kweekomstandigheden. Daarentegen Foxd3 mutantNC was sterk verminderd cel uitwassen in normoxia (rode contouren merk randen van de NC uitwassen). Bij vergelijkbare explantaten werden gekweekt onder hypoxische condities, Foxd3 mutant NC explantaten groeide vergelijkbaar met controles, waardoor latere analyses. Let op, dit gedrag goed gecorreleerd met het gedrag van Foxd3 mutant NC in vivo.

Discussie

Zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan het ontwikkelingsstadium van het embryo aan het succes van deze aanpak te garanderen. Tellen somieten van de vroege muizenembryo's is van cruciaal belang voor zowel het podium bijpassende embryo's in een nest en het bepalen van de juiste regio's van de neurale buis voor isolatie. Een variatie van een of twee somieten tussen embryo binnen een redelijk aantal ontwikkelingstiming, afhankelijk van de resolutie van de uitgevoerde experimenten. Een embryo tussen 9 en 9,...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
DMEM (lage glucose)	Gibco / Invitrogen	11885
Neurobasal Medium	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
DPBS	Gibco	14190-144
IGF-1	BD Biosciences	354037	Winkel in 50 ug / ml fracties bij -20 ° C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Winkel in 25 ug / ml fracties bij -20 ° C.
Fibronectine	Gibco	33016-015	Opgeslagen in 1mg/ml aliquots bij -20 ° C.
Retinoïnezuur	Sigma	R2625	Winkel in 35 ug / ml monsters na bereiding in ethanol bij -20 ° C.
2-mercaptoethanol	Sigma	D-5637
N 2 supplement	Gibco	17502-048
B27 supplement	Gibco	17504-044
Steriflip 0,22 pm filters	Millipore	SCGP00525
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140122
0,20 micrometer filters	Corning	431219
Spuiten (voor filtratie)	BD Biosciences	301604
Vier putjes	Thermo Fisher Scientific	176740
Collagenase / Dispase	Roche	269 ​​638	Activiteit verschilt per partij. Winkel in 100 mg / ml fracties bij -20 ° C.
Insuline naalden (29 ½ gage)	Becton Dickson	309306
Hypoxie Kamer	Billups-Rothenberg
Oxygen Analyzer	Billups-Rothenberg
Pincetten # 5	Fine Science Tools		Voor het verwijderen van baarmoeder en de decidua.
Trypsine-EDTA (0,25%)	Gibco	25200