Aneurysmatische subarachnoïdale bloeding (SAB) is bloeden die optreedt in de subarachnoïdale ruimte bij een aneurysma scheurt. Terwijl de morbiditeit en mortaliteit van deze gebeurtenis is op een daling door verbeterde behandelmethoden, het risico van vasospasme na subarachnoïde bloeding blijft hetzelfde als enkele jaren geleden. Het belang van de oprichting van een uitgebreide en reproduceerbaar diermodel om beginfase van cerebrale vasospasme te identificeren is de focus van het onderzoek sinds het eerste gebruik van ratten in een experimenteel vasospasme model in 1979 door Barry Et al. Vroege werk in ratten aangetoond dat een enkele injectie van autoloog bloed in de cisterna magna tot acute (binnen enkele minuten) maar niet vertraagd cerebraal vasospasme 3, 6, 14. Hier hebben we karakteriseren een lage sterfte SAH rat-model dat resulteert in reproduceerbare vertraagde vasospasme.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een lage sterfte Rat Model voor uitgestelde Cerebrale Vasospasme Beoordeel na experimentele subarachnoïdale bloeding
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Doelstelling: karakteriseren en stellen een reproduceerbaar model die vertraagde cerebraal vasospasme na toont aneurysmatische subarachnoïdale bloeding (SAH) in ratten om de beginfase, pathofysiologische veranderingen en potentiële targets voor behandeling te identificeren.
Methods: Achtentwintig mannelijke Sprague-Dawley ratten (250 - 300 g) werden willekeurig toegewezen aan een van twee groepen - SAH of zoutoplossingcontrole. Rat subarachnoïdale bloeding in de SAH groep (n = 15) werd geïnduceerd door dubbele injectie van autoloog bloed 48 uur apart, in de cisterna magna. Ook normale zoutoplossing (n = 13) werd geïnjecteerd in de cisterna magna van de zoutoplossing controlegroep. Ratten werden opgeofferd op dag vijf na de tweede injectie bloed en de hersenen werden bewaard voor histologisch onderzoek. De mate van vasospasme werd gemeten met delen van de basilaire slagader, door het meten van de interne luminale dwarsdoorsnede met NIH Image-J software. De betekenis wasgetest met behulp van Tukey / Kramer 's statistische analyse.
Resultaten: Na analyse van coupes, basilaire slagader luminaal doorsnede kleiner dan in de SAB in de zoutoplossing groep overeenstemming met cerebraal vasospasme in de eerste groep. In de SAH groep basilaire slagader binnenoppervlakte (0,056 um ± 3) aanzienlijk kleiner van vasospasme vijf dagen na de tweede injectie bloed (zeven dagen na de eerste injectie bloed), vergeleken met de saline controlegroep binnenoppervlakte (0,069 ± 3, p = 0,004). Er waren geen sterfgevallen door cerebraal vasospasme.
Conclusie: De rat dubbele SAH model veroorzaakt een mild, duurzame, basilaire slagader vasospasme die kunnen worden gebruikt om de pathofysiologie van cerebrale vasospasme studie in een klein diermodel. Een laag en aanvaardbaar sterftecijfer is een belangrijk criterium moet worden voldaan voor een ideaal SAH diermodel, zodat de mechanismen van vasospasme kan elucid wordenated 7, 8. Verdere modificaties van het model kan worden gemaakt om te passen voor verhoogde ernst van vasospasme en neurologische onderzoeken.
Protocol
1. Rat Chirurgie voor SAH Onderwerp geïnjecteerd met 0,15 ml autoloog Arterial Blood
- De rat wordt verdoofd met 0,1 mg / kg ketamine / xylazine knaagdier cocktail en toegestaan om te zitten gedurende 5 minuten.
- Adequate anesthesie wordt bevestigd door vermindering van de achterste ledematen reflex.
- Met behulp van een elektronisch scheerapparaat een nek aan de oppervlakte van het haar neus rond de sub-occipitale regio wordt geschoren.
- Het dier is liggende op de operatie tafel en de staart wordt gereinigd met betadine op een steriele incisie te garanderen.
- Een rechte 1 cm middellijn incisie wordt gemaakt op het ventrale aspect van de staart
- De dissectie wordt verlengd tot de staart slagader is geïdentificeerd en geïsoleerd.
- Met een steriele 26-gauge katheter, wordt de staartarterie canule en 0,15 ml van arterieel bloed met een spuit.
- Een steriel gaas rond de incisie om hemostase zorgen voor toepassing van de vetbond de incisie te dichten.
- Thij rat is ingeschakeld gevoelig op de tafel en het geschoren gebied over de sub-occipitale regio wordt gereinigd met betadine.
- Met behulp van een verticale middellijn incisie toegang wordt verkregen tot de cisterna magna.
- Na identificatie van een 25 gauge naald in de cisterna magna en 0,15 ml CSF wordt met een spuit verhoogde intracraniale druk met injectie van autoloog bloed volume voorkomen.
- Nu wordt de 0,15 ml bloed uit de staartarterie langzaam geïnjecteerd in de cisterna magna.
- De naald blijft zitten gedurende 30 seconden te zorgen stolling in de subarachnoïdale ruimte en dan voorzichtig teruggetrokken.
- Hemostase is verzekerd en de incisie wordt gesloten met behulp van een nieten apparaat.
- Het dier wordt nu geplaatst gevoelig op een opwarming oppervlak met een 20 ° hoofd naar beneden positie gedurende 20 minuten om het bloed te laten stollen in de reservoirs rond de basilaire slagader.
- 1,1 tot 1,15 stappen worden herhaald gedurende de tweede operatie 48 uur apart.
2. Rat Chirurgie voor SAH Onderwerp geïnjecteerd met 0,15 ml Saline
- De rat wordt verdoofd met 0,1 mg / kg ketamine / xylazine knaagdier cocktail en toegestaan om te zitten gedurende 5 minuten.
- Adequate anesthesie wordt bevestigd door vermindering van de achterste ledematen reflex.
- Met behulp van een elektronisch scheerapparaat een nek aan de oppervlakte van het haar neus rond de sub-occipitale regio wordt geschoren.
- Het dier is liggende op de operatie tafel en de staart wordt gereinigd met betadine op een steriele incisie te garanderen.
- Een rechte 1 cm middellijn incisie wordt gemaakt op het ventrale aspect van de staart
- De dissectie wordt verlengd tot de staart slagader is geïdentificeerd en geïsoleerd.
- Met een steriele 26-gauge katheter, wordt de staartarterie canule en 0,15 ml van arterieel bloed met een spuit.
- Een steriel gaas rond de incisie om hemostase zorgen voor toepassing van de vetbond de incisie te dichten.
- De rat is ingeschakeld gevoelig op de tafel en het geschoren gebied over de sub-occipitale regio is beschilderd met betadine.
- Met behulp van een verticale middellijn incisie toegang wordt verkregen tot de cisterna magna.
- Na identificatie van een 25 gauge naald in de cisterna magna en 0,15 ml CSF wordt met een spuit en het monster wordt opgeslagen.
- Nu wordt de 0,15 ml normale fysiologische zoutoplossing (37 ° C) langzaam geïnjecteerd in de cisterna magna.
- De naald blijft op zijn plaats gedurende 30 seconden en zorgvuldig ingetrokken.
- Hemostase is verzekerd en de incisie wordt gesloten met behulp van een nieten apparaat.
- Het dier wordt nu geplaatst gevoelig op een oppervlak met een warming 20 ° kop omlaag gedurende 20 minuten.
- Stappen 2,1 tot 2,15 worden herhaald tijdens de tweede operatie 48 uur uit elkaar.
3. Rat Sacrifice
- Op dag 5 na de tweede operatie worden de ratten gedood door cardiale perfusie.
- De rat krijgt een fatale dosis (00,2 ml / kg) van Fatal Plus (Vortech PHARMACEUTICALS LTD., Dearborn, MI)
- Met een verticale incisie wordt de buikholte benaderd en het buikvlies geopend.
- Een anterieure thoracotomie wordt uitgevoerd en het hart wordt blootgesteld.
- Met een 26-gauge katheter verbonden met een fosfaatbuffer (PBS pH 7,4 en bij 37 °) van het dier bloed afgetapt en vervolgens geperfuseerd met 4% paraformaldehyde.
- Na een adequate perfusie, wordt de perfusie gestopt en de rat wordt overgebracht naar de onthoofding tafel.
- Na onthoofding, is een bot rongeur gebruikt om de schedel voor de hersenen verwijderen te verwijderen.
- De hersenen en de hersenstam worden zorgvuldig uit het neurocranium en in een 4% paraformaldehyde oplossing en bewaard bij 4 ° C gedurende 48 uur.
4. Het creëren van secties te Vasospasme beoordelen
- De hersenen van de rat die nu is in 30% sucrose ondergedompeld gedurende 4 dagen wordt gebracht om ee cryostaat voor het snijden.
- Eenmaal cryoprotected, 12 uM secties worden gemaakt met behulp van de cryostaat, met de Anterior Inferior Cerebellaire slagader (AICA) als uitgangspunt om inter-individuele consistentie te waarborgen.
- 20 secties zijn gemaakt voor elk dier, eindigend bij de Superior Cerebellaire slagader (SCA).
- De secties worden geplaatst op een glasplaatje en beoordeeld op vasospasme met behulp van histologische methodologie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de protocollen hierboven beschreven zijn er verschillende stappen waarvan wij denken vereist een beter karakterisering van het model dan is eerder beschreven in de literatuur. Hier richten we ons op de stappen die essentieel zijn om tot een reproduceerbare lage sterfte cerebrale vasospasme kleine diermodel te bereiken en te voorkomen dat mogelijke valkuilen in verband met dit model als het niet goed gedaan.
1. Autoloog bloed te trekken uit de Staart Artery:
Zorgv...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Primaten, met een meer vergelijkbare genetische samenstelling en anatomische eigenschappen van de mens, beter de gebeurtenissen van vertraagde cerebrale vasospasme na te bootsen en kunnen gemakkelijker ze een niet-invasieve beeldvorming (MRI en angiografie) om arteriële veranderingen, dan knaagdieren 8 monitoren. Echter, primaatmodellen zijn kosten prohibitief en geassocieerd met meer complexe zorg en ethische kwesties, dan kleine diermodellen. Klein dier SAH modellen ontwikkeld eerder gericht op drie werkwij...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te met betrekking tot dit onderzoek bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen de inspanningen van Dr Mary-Lou Vallano, Afdeling Neurowetenschappen en Fysiologie, erkennen voor haar waardevolle input in de up te schrijven voor dit manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van de apparatuur / reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | |
| Mannelijke SD ratten (250-300 g) | Taconic | SD-M | |
| 26 G Katheters | Webster | 8416683 | |
| 25 G naalden | Buffel | 305122 | |
| 1 cc spuiten | Centraal winkels | 54245 | |
| Ketamine / Xylazine cocktail | Animal Care (SUNY) * | - | |
| Betadine | Centraal winkels | 51458 | |
| Sucrose | Sigma | S9378-1kg | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | |
| Fosfaatbufferoplossing | Visser | BP-399-4 | |
| Operatietafel | Harvard | PY2 72-2.590 | |
| Oktober Verbinding (cryoprotection) | VWR | 25608-930 | |
| Superfrost Slides | Visser | 12-550-15 |
* Gesynthetiseerd bij Department of Laboratory Animal Care, SUNY Upstate Medical University. Voeg 1 cc [100 mg / ml] van Xylazine tot 10 ml [100 mg / ml] van Ketamine.
Referenties
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Cheng, G., Wei, L., Zhi-Dan, S., Shi-Guang, Z., Xiang-Zhen, L. Atorvastatin ameliorates cerebral vasospasm and early brain injury after subarachnoid hemorrhage and inhibits caspase-dependent apoptosis pathway. BMC Neurosci. 10, 7-17 (2009).
- Jackowski, A., Crockard, A., Burnstock, G., Russell, R. R., Kristek, F. The time course of intracranial pathophysiological changes following experimental subarachnoid hemorrhage in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 10, 835-849 (1990).
- Kaoutzanis, M., Yokota, M., Sibilia, R., Peterson, J. W. Neurologic evaluation in a canine model of single and double subarachnoid hemorrhage. J. Neurosci. Methods. 50, 301-307 (1993).
- Karaoglan, A., Akdemir, O., Barut, S., Kokturk, S., Uzun, H., Tasyurekli, M., Colak, A. The effects of resveratrol on vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Surg. Neurol. 70, 337-343 (2008).
- Lee, J. Y., Huang, D. L., Keep, R., Sagher, O. Characterization of an improved double hemorrhage rat model for the study of delayed cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 168, 358-366 (2008).
- Lee, J. Y., Sagher, O., Keep, R., Hua, Y., Xi, G. Comparison of experimental rat models of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (2), 331-343 (2009).
- Megyesi, J. F., Vollrath, B., Cook, D. A., Findlay, J. M. In vivo animal models of cerebral vasospasm: a review. Neurosurgery. 46, 448-460 (2000).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. A. Experimental subarachnoid hemorrhage: Subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52, 165-176 (2003).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Svendgaard, N. A. Experimental subarachnoid hemorrhage: Cerebral blood flow and brain metabolism during the acute phase in three different models in the rat. Neurosurgery. 54, 426-436 (2004).
- Ryba, M. S., Gordon-Krajcer, W., Walski, M., Chalimoniuk, M., Chrapusta, S. J. Hydroxylamine attenuates the effects of simulated subarachnoid hemorrhage: implication for the role of oxidative stress in cerebral vasospasm. Neurol. Res. 31, 195-199 (1999).
- Satoh, M., Parent, A. D., Zhang, J. H. Inhibitory effect with antisense mitogen-activated protein kinase oligodeoxynucleotide against cerebral vasospasm in rats. Stroke. 33, 775-781 (2002).
- Suzuki, H., Kanamaru, K., Tsunoda, H., Inada, H., Kuroki, M., Sun, H., Waga, S., Tanaka, T. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. J. Clin. Invest. 104, 59-66 (1999).
- Swift, D. M., Solomon, R. A. Subarachnoid hemorrhage fails to produce vasculopathy or chronic blood flow changes in rats. Stroke. 19, 878-882 (1988).
- Vatter, H., Weidauer, S., Konczalla, J., Dettmann, E., Zimmermann, M., Raabe, A., Preibisch, C., Zanella, F., Seifert, V. Time course in the development of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage: clinical and neuroradiological assessment of the rat double hemorrhage model. Neurosurgery. 58, 1190-1197 (2006).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Zubkov, A. Y., Nanda, A., Zhang, J. H. Signal transduction pathways in cerebral vasospasm. Pathophysiology. 9, 47-61 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
