On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Samenvatting

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

Samenvatting

Atherogenese wordt versterkt door metabole afwijkingen die bijdragen aan een verhoogde staat van systemische ontsteking leidt tot disfunctioneren van het endotheel. Echter, begin van de functionele veranderingen in endotheel, dat betekent een individu niveau van het risico niet direct klinisch onderzocht naar de gids van therapeutische strategie te helpen. Bovendien, de regulering van ontsteking door lokale hemodynamica draagt ​​de niet-random ruimtelijke verdeling van atherosclerose, maar de mechanismen moeilijk af te bakenen in vivo. We beschrijven een lab-on-a-chip gebaseerde benadering van kwantitatief onderzoek metabole verstoring van inflammatoire gebeurtenissen in de menselijke endotheelcellen (EC) en monocyten in een zeer nauwkeurige voorwaarden. Standaardmethoden van zachte lithografie worden vasculaire mimetische microfluïdische kamers (VMMC), die direct gebonden aan gekweekte EC monolagen microfabricate. ^Een deze inrichtingen hebben het voordeel van het gebruik van kleine hoeveelheden reagentia terwijleen platform voor direct beeld van de ontstekingen in het membraan van EC blootgesteld aan een welbepaalde shear veld. We hebben succes toegepast deze apparaten cytokine, ^{2 lipide-3, 4} en RAGE-geïnduceerde ⁵ ontsteking in menselijke aorta EC (HAEC) onderzoeken. Hier aantonen hoe de VMMC voor het testen van monocyten cel (THP-1) wals en stilstand van HAEC monolagen die geconditioneerd onder differentiële afschuiving eigenschappen en geactiveerd door inflammatoire cytokine TNF-α. Studies zoals deze zijn het verstrekken van mechanistisch inzicht in atherosusceptibility onder metabolische risicofactoren.

Protocol

1. Cel Cultuur en Voorbereiding van de ondergrond

1. Snijd 3-inch ronde substraten van een 100 x 20 mm weefselkweek schotel (BD Falcon) met behulp van een draaibank. Steriliseer substraten door onderdompeling in 70% ethanol. Plaats in een petrischaal en mantel met 4 ml type I collageen (100 ug / ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur spoel met 4 ml 1 x PBS.
2. Hang Human Aorta endotheelcellen (HAEC, passage 4-6) op 6.5x10 ⁵ cellen / ml en het zaad door het toepassen van 1 ml direct op substraat. Plaats in een 37 ° C, _5% CO2 incubator en laat cellen hechten aan het substraat gedurende 1 uur.
3. Voeg 9 ml endotheliale groei Medium-2 (EGM-2) aangevuld met 1 x antibiotica antimycotische oplossing aan de cellen. Wijzig de media om de 2 dagen tot de cellen tot 90% confluentie.
4. Handhaaf THP-1-cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica 1x antimycotische oplossing. Passage cellen wanneer zij een dichtheid van 1 bereiken0 ⁶ cellen / ml.

2. Cell Shearing Protocol

De cellen worden geconditioneerd in een aangepaste kegel-plaat Cell Shearing Device (CSD). Apparaat details en specificaties van het ontwerp zijn aangegeven in tabel 1 en figuur 4.

1. Bereid de CSD. Steriliseer de kamer behuizing met ethanol en spoel af met steriele PBS. Verwarm de behuizing 37 ° C en om te waarborgen dat de kegel loodrecht op de celmonolaag. Zet het substraat met de cellen van de bodem van het huis en zet de kegel op de gewenste hoogte.
2. Gebruik Leibovitz-15 (L-15) medium aangevuld met Endothelial BulletKit de afschuiving medium juiste pH in afwezigheid van CO _{2 te} handhaven. Om ontsteking stimuleren toe tumor necrosis factor-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) om de afschuifkrachten medium en injecteer 6 ml in de inrichting via een spuit verbonden met een inlaatpoort en zorg geen lucht te voerenbubbels in de kamer.
3. Shear-cellen met een hoge mate stabiele shear stress (HSS, 15 dyne / cm ²⁾ of een oscillerende shear stress (OSS, 0 ± 5 dyne / cm ^2, 1 Hz) voor 4 uur. De gewenste SS wordt bereikt door aan de kegel boven de cellen die juist wordt met een micro-stappenmotor als eerder beschreven ⁶ wand SS aan het oppervlak (τ _w) wordt benaderd door.:
   
   waarbij μ is de viscositeit van het medium, ω de hoeksnelheid van de kegel en α de kegelhoek (0,5 °). De kegel aanpassing aan het substraat is aangepast om binnen 0,05 ° door nauwkeurige nivellering en de kloof hoogte vastgesteld op 20 ± 10 urn met behulp van een dieptemeter om omtrek en radiale variatie in τ _w minimum te beperken. Het apparaat is gevalideerd voor laminaire stroming kenmerken te garanderen. Verwijder cel van het apparaat en voor te bereiden op de analyse van monocyten hechting.

3. Fabricage van PDMS Microfluïdische Kamer

1. Haal meester mal voor gewenste microfluïdische kanaalnummer en de kanaalnaam hoogte afhankelijk van de toepassing. De kenmerken van het specifieke ontwerp wordt gebruikt in dit protocol zijn weergegeven in tabel 1. De methode voor het creëren van deze is al goed gedocumenteerd in de literatuur. ^Een kort, het netwerk van kanalen wordt ontworpen met behulp van CAD-software (Autodesk Inventor) en gedrukt bij 5000 dpi op een transparant. Negatieve fotoresist (SU8) wordt gesponnen op een siliciumplak met een dikte van 100 pm. De transparantie is bedekt en blootgesteld aan UV-licht. Niet-gepolymeriseerde fotolak verwijderd met de positieve replica meester genereren.
2. Om PDMS oplossing te mengen basis van siliconen te maken met siliconen verharder 10:01, berekend op een gewicht van boot en roer met een 5 ml serologische pipet. Zorg ervoor dat u de muren te schrapenvan de wegen boot om te voorkomen dat het toevoegen van plastic vlokken aan de oplossing.
3. Plaats de master wafer in een 100x15mm petrischaal en giet het PDMS oplossing in de schotel.
4. Dek de schaal af en plaats deze in een vacuüm verpakking gedurende 15 minuten om bellen te verwijderen. Na 15 minuten de petrischaal uit en verwijdert het overtollige luchtbellen door voorzichtig te blazen lucht over het oppervlak.
5. Plaats Petri schaal in een oven gedurende 1 uur bij 70 ° C. Verwijder de schaal en knip de microfluïdische kamers met een scherp mes.

4. Vergadering van Device op Microscoop

1. Zet lichtbron omgekeerde microscoop en zet verwarming op 37 ° C. Bevestig de slang aan een 10 ml spuit en vul met gedestilleerd water zodanig dat er geen luchtbellen. Plaats de spuit in de spuit pomp en de ingestelde stroom aan een wand SS van 1 dyne / cm ² induceren. De afschuifspanning (τ _w) gegenereerd gedurende de hartlijn van het kanaal wordt benaderd met de standaardvergelijking voor een parallelle plaat flow chamber:
   
   waarbij μ is de viscositeit van het medium, Q de volumetrische stroomsnelheid, h de goothoogte en w de kanaalbreedte. Opmerking: aangezien de kanalen van eindige breedte van de werkelijke τ _w varieert met w afhankelijk van het kanaal beeldverhouding en metingen vermeden 25% dichtst bij de zijwanden. ^1,7
2. Plaats PDMS kamer in het water en gebruik een 100 ul micropipet om lucht te verwijderen uit de individuele kanalen. Bevestig vacuüm adapter aan op kamer ervoor te zorgen dat de klep is uitgeschakeld.
3. Plaats petrischaal met HAEC monolaag op het streven. Plaats de PDMS kamer over de petrischaal en zorgvuldig in te stellen op de HAEC monolaag tegelijkertijd te verzekeren dat er geen luchtbellen vormen tussen het apparaat en de monolaag. Draai de klep zodat het vacuüm is ingeschakeld en de kamer wordt stevig bevestigd.
4. Snij 19 gauge naald bot zodanig dat slechts 5 mm metaal links. Vul de plastic reservoir met buffer en in PDMS kamer ingang. Herhaal passend aantal kanalen worden gebruikt. Bevestig de slang van de spuit pompen PDMS kanaal uitgangen.

5. Monocyten Hechting Assay Onder Afschuifspanning

1. Suspendeer THP-1 cellen 2x10 ⁶ cellen / ml in HBSS + ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +} + 0,1% HSA. Activeer THP-1 cellen door incubatie met stroma afgeleid factor-1 (SDF-1, 50 ug / ml) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
2. Zet spuitpomp te stromen vast te stellen, voeg dan 50 pi van celsuspensie naar het reservoir zonder dat er luchtbellen. Zodra stroom volledig is ontwikkeld, begint data-acquisitie.
3. Gedurende 5 minuten bij toepassing debiet buffer toe te voegen aan het reservoir indien de oplossing laag wordt. Ga verder stroomt buffer in de kanalen te wassen uit een ongebonden cellen in de stroom stroom.

6. Data-acquisitie en-analyse

1. Verwerven digitale beeld reeksen 3 frames / s gedurende 2 min na volle stroming langs de lengteas van het kanaal 3 locaties in het kanaal zorg niet onmiddellijk na binnenkomst of voor uitgangspoorten of 25% opnemen dichtst bij de zijkant wanden.
2. Tel het aantal gearresteerde cellen per veld door het identificeren van hun fase-heldere verschijning in dezelfde focal plane als de monolaag.
3. Firm cel arrestatie wordt gedefinieerd door beweging <½ cel diameter in 10 s. Gemiddelde data over 3 willekeurige velden / kanaal en te kwantificeren met behulp van ImageJ software.

7. Representatieve resultaten

Hoewel het vasculair endotheel is gelijkmatig blootgesteld aan agonisten die bijdragen aan systemische ontsteking, atherosclerose is een ziekte die centraal bij voorkeur ontwikkelt op plaatsen van stroom storing in de slagaders, wat impliceert ruimtelijke heterogeniteit in endotheelfunctie. ⁸ Circulerende ontstekingsmediatoren zoals TNF-α worden verhoogd in menselijk serum onder metabole stress en correleren met een verminderde werking van het endotheel. ^{9, 10} TNF-α leidt tot een goed gekarakteriseerde reactie in EG, dat up-regulatie van cel adhesie moleculen (CAM's bevat , bijvoorbeeld VCAM-1, ICAM-1, E-selectine) en chemokines die personeel werven monocyten uit de circulatie, een kenmerk van de vroege atherosclerose ¹¹ Hemodynamica is een belangrijke regulator van endotheliale inflammatoire fenotype ¹² High magnitude shear stress (HSS..; bijv. 15 dynes / cm ²⁾ of pulsatiele shear stress (PSS, bijv. 15 ± 5 dynes / cm ²⁾ bij sites van de weerstand tegen atherosclerose in de slagaders TNF-α-geïnduceerde responsen down-reguleren. Omgekeerd, lage magnitude shear stress (LSS, bijv. 2 dynes / cm ²⁾ of oscillerende shear (OSS; bijv. 0 ± 5 dynes / cm ^2), kenmerk van gevoelige locaties in vivo, verergeren cytokine-geïnduceerde ontsteking. ^{13, 14} Onze microfluïdische PDMS-apparaten bieden een platform voor het uitvoeren van mechanistische studies om hypothesen met betrekking tot de superpositie van metabole stress met hydrodynamische factoren in de regulering van de endotheliale functie en pathologie te testen. Het nut en de veelzijdigheid van de aanpak wordt breed geïllustreerd door de volgende representatieve resultaten.

Figuur 1. Afschuifspanning moduleert verschillend THP-1-cel adhesie aan TNF-α ontstoken endotheliale monolagen. Deze gegevens werden verkregen met behulp van de gedetailleerde protocol hierboven beschreven en gedocumenteerd in de video. HAEC monolagen werden gelijktijdig blootgesteld aan een lage dosis van het inflammatoire cytokine TNF-α (0,5 ng / ml, ~ _EC50 voor VCAM-1 tot-regulering) en ofwel HSS (15 dynes / cm ²⁾ of OSS (0 ± 5 dynes / cm ^2, 1 Hz) in een aangepaste CSD voor 4 uur aan zoalsbed in de gedetailleerde protocol. THP-1-cel arrestatie werd gekwantificeerd onder afschuiving stroming in een PDMS flow chamber. Deze cellijn dat het fenotype van humane monocyten bootst werd gekozen vanwege zijn reproduceerbaarheid en gebruiksgemak. HSS verzwakt de ontstekingsreactie in vergelijking met OSS, wat resulteert in een vermindering van THP-1-cel arrestatie. De gegevens werden geanalyseerd door Student's t-test en worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van 3 onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van DeVerse et al. ^5.

De volgende gegevens tonen de veelzijdigheid van onze aanpak met behulp van voorbeelden uit onze gepubliceerde werk. Afwijkingen van de bovenstaande protocol worden aangegeven waar van toepassing.

Figuur 2. Modulatie van cytokine-geïnduceerde VCAM-1 expressie en monocyt werving in een shear stress gradiënt. A) HAEC monolagen werden gestimuleerd met TNF-α (0,3 ng / ml) gedurende 4 uur onder flow in VMMC ontworpen gebaseerd op Hele-Shaw stromingsleer ^15. een lineaire afname SS grootte langs de hartlijn van het kanaal is bereikt door de zijwanden van de kamer te laten samenvallen met de stroomlijnen van een tweedimensionale stagnatie stromen en vormen het einde van het kanaal naar de iso-potentieel lijnen overeenkomen. De afschuifspanning (τ _w) gegenereerd gedurende de hartlijn van het kanaal op een axiale afstand van de ingang (x) wordt gegeven door:

waarbij μ is de viscositeit van het medium, Q de volumetrische stroomsnelheid, h de goothoogte, w ₁ het kanaal doorgangsbreedte, en L de totale kanaallengte. Q is gekozen om een gradiënt in SS grootte genereren van 16 dynes / cm ² bij de inlaat van 0 in de stagnatie "a" net proximaal de outlet. B)-C) VCAM-1 expressie werd gemeten in situ door immunofluorescentie microscopie met behulp van antilichamen geconjugeerd met quantum dots en weergegeven als een percentage mediane fluorescentie-intensiteit (MFI's) van de niet-gestimuleerde statische controle. SS niet moduleren het basale niveau van VCAM-1, die laag in ongestimuleerde HAEC (grijs driehoeken). Echter, VCAM-1 expressie gestegen ten opzichte van TNF-α bij LSS grootheden, met een piek van ~ 2 dynes / cm ² en terug te keren naar de TNF-α basislijn of lager dan op afschuiving grootheden> 5 dynes / cm ² (zwarte vierkantjes). D) Monocyten (10 ⁶ / ml) werden bij 2 geperfundeerd dynes / cm ² 5 min parallel stromingskanalen via monolagen geconditioneerd als in A). Monocyten instroom endotheel kwantitatief gecorreleerd met de VCAM-1 expressie op een bepaalde schuifspanning grootte. Met name de mogelijkheid VCAM-1 expressie en monocyt rekrutering sonde met fijne ruimtelijke resolutie in monolayer significante veranderingen bleek een smal bereik in SS grootte die niet gewaardeerd door slechts enkele discrete waarden van afschuiving in afzonderlijke experimenten. De gegevens werden geanalyseerd door herhaalde metingen ANOVA en verschillen beoordeeld door Newman-Keuls nameting, * P <0,05 van TNF-α onder statische omstandigheden. De gegevens worden gemiddelde ± SEM drie tot zes onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van Tsou et al.. ²

Figuur 3. Triglyceriden-rijke lipoproteïnen (TGRL) moduleren cytokine-geïnduceerde ontsteking in verhouding tot donor serum triglyceride niveaus en VCAM-1 expressie. HAEC monolagen werden gestimuleerd met TNF-α (0,3 ng / ml) gedurende 4 uur gelijktijdig met TGRL (10 mg / dl ApoB) geïsoleerd uit menselijke proefpersonen na een vetrijke maaltijd in statische cultuur. A) VCAM-1 expressie werd apart gemeten in zwevend EG door middel van flowcytometrieen monocyt hechting gekwantificeerd met een VMMC zoals beschreven in de gedetailleerde protocol. De gegevens worden voorgesteld als% verandering van TNF-α. Monocyten arrestatie gevarieerd in verhouding tot endothelial VCAM-1 expressie, die direct vermeerderd met de hoogte van donor serum triglyceriden. B) Monocyt arrest een subset van pro-inflammatoire donoren ingetrokken in aanwezigheid van een VCAM-1 blokkerend antilichaam. Significantie werd bepaald door gepaarde Student's t-test, betekent ± SEM 3-5 onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van Wang et al.. ⁴

Discussie

We beschrijven het gebruik van microfluïdische PDMS apparaten voor de on-chip beoordeling van de endotheliale inflammatoire fenotype door de real-time beeldvorming van CAM expressie en monocyten hechting. Een groot voordeel van onze aanpak ligt in het vermogen om de resultaten in verband met disfunctioneren van het endotheel in de cellen blootgesteld aan ontstekingsmediatoren zoals dieet lipiden en cytokines onder gedefinieerde hydrodynamische omstandigheden die shear stress een afspiegeling van de atherogene schepen te...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Item	Vennootschap	Catalogus nummer
100 x 20 mm Petrischalen	BD Falcon	353003
Ethanol 95%	Merck Chemicals	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21 tot 031-CV
Type I Rat Tail Afgeleide Collageen	Gibco	A10483-01
Human Aorta endotheelcellen	Genlantis	PH30405A
Antibiotica-Antimycoticum Solution	Invitrogen	15240-062
Endotheliale BulletKit	Lonza	CC-4176
Endotheliale Basale Media-2	Lonza	CC-3156
10 ml spuiten	BD Falcon	309604
Polyurethaan slang	Tygon	ABW0001
Leibovitz-15 Media	Gibco	11415-069
Sylgard 184 Silicone-elastomeer Base	Dow Corning	184
Sylgard 184 siliconelastomeerfase Verharder	Dow Corning	184
SU8 fotolak Master Wafer	UC Davis Pan Lab	N / A
Eclipse TE200 omgekeerde microscoop	Nikon	Eclipse TE200
Spuitpomp	Harvard Apparatuur	PHD2000
19 gauge injectienaald	Kendall	8881
THP-1 monocytische cellijn	ATCC	TIB-202
HBSS (Hanks zoutoplossing) met Ca2 + / Mg2 +	Gibco	14025-092
Tumor Necrosis Factor Alfa (TNF-α)	R & D Systems	210-TA-010
Stromale afgeleide Factor - 1 (SDF-1)	R & D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10 tot 040-CV
Humaan serum albumine (HSA)	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32