Een toolkit voor de omzetting van koolwaterstoffen inschakelen in waterige milieus

Samenvatting

Een duurzame auto regelen van bacterieel systeem voor de sanering van olieverontreinigingen werd ontworpen met behulp van standaard verwisselbare DNA delen (BioBricks). Een aangelegde E. coli Stam werd gebruikt om alkanen via β-oxidatie afgebroken in toxische waterige omgevingen. De respectieve enzymen van verschillende soorten toonde alkaan degradatie activiteit. Daarnaast werd een verhoogde tolerantie voor N-Hexaan werd bereikt door genen van alkaan-tolerante bacteriën.

Samenvatting

Dit werk voert een toolkit die de omzetting van alkanen in staat stelt door Escherichia coli en presenteert een proof of principle van de toepasbaarheid. De toolkit bestaat uit meerdere standaard verwisselbare onderdelen (BioBricks) ⁹ aanpakken van de omzetting van alkanen, regulatie van genexpressie en overleving in toxische koolwaterstof-rijke omgevingen.

Een drie-stap route voor alkaan afbraak werd in E. coli de omzetting van middellange-en lange-keten alkanen hun respectieve alkanolen, alkanalen en uiteindelijk alkaanzuren-zuren toestaat. Zij werden omgezet via het natieve β-oxidatie pathway. De oxidatie van middellange-keten alkanen (C5-C13) en cycloalkanen (C5-C8), vier genen (alkB2, rubA3, rubA4 en Rubb) van het alkaan hydroxylase systeem Gordonia sp vergemakkelijken. TF6 ^8,21 werden getransformeerd in E. coli. Voor de omzetting vanlangketenige alkanen (C15-C36), werd het gen van Lada Geobacillus thermodenitrificans uitgevoerd. Voor de vereiste verdere stappen van het afbraakproces, werden ADH en ALDH (afkomstig van G. thermodenitrificans) geïntroduceerd ^10,11. De activiteit werd gemeten door rustende cel assays. Voor elke oxidatieve stap, werd de enzymactiviteit waargenomen.

Om het proces te optimaliseren, werd de expressie geïnduceerd onder enige laag glucose omstandigheden: een substraat gereguleerde promoter, pCaiF, gebruikt. pCaiF aanwezig in E. coli K12 en de expressie van de genen betrokken bij de afbraak van niet-glucose koolstofbronnen.

Het laatste deel van de toolkit - targeting overleving - werd uitgevoerd met behulp van oplosmiddel tolerantie genen, PhPFDα en β, beiden uit Pyrococcus horikoshii OT3. Organische oplosmiddelen kunnen induceren cel stress en verminderde overlevingskansen door negatief affecting eiwit vouwen. Zoals chaperones, PhPFDα en β verbeteren eiwit vouwproces bijvoorbeeld in de aanwezigheid van alkanen. De expressie van deze genen geleid tot een verbeterde koolwaterstof tolerantie aangetoond door een verhoogde groeisnelheid (tot 50%) in de aanwezigheid van 10% n-hexaan in het kweekmedium waargenomen.

Samenvattend, de resultaten aan dat de E. toolkit kan coli te zetten en koolwaterstoffen tolereren in waterige omgevingen. Als zodanig is het is een eerste stap op weg naar een duurzame oplossing voor de olie-sanering met behulp van een synthetische biologie aanpak.

Inleiding

Olieverontreiniging behoort tot de ernstigste oorzaken van milieuverontreiniging en heeft een grote invloed op ecosystemen, bedrijven en gemeenschappen ³. Er zijn bijvoorbeeld oplossingen nodig om de voortdurende olieverontreiniging die afkomstig is van de afvalwaters van de oliezanden in Alberta, Canada, te bestrijden. Tijdens het proces van olie-extractie uit oliezand wordt bitumen, een semi-solide geoxideerde vorm van olie, verwijderd met behulp van thermische hersteltechnieken die ongeveer 3,1 vaten water per enkel vat olie verbruiken ¹. Het door olie vervuilde proceswater, dat voornamelijk afkomstig is van een lokale rivier, wordt opgeslagen in afvalwaterbekkens na de extractie van bitumen. Er is een effectievere recycling van proceswater nodig om de behoefte aan zoetwateropname te verminderen. Om de extractie van bitumen te vergemakkelijken en ervoor te zorgen dat downstream-locaties voldoen aan de waterkwaliteitsrichtlijnen voor de bescherming van aquatische ecosystemen, evolueren proceswaterbehandelingen snel ³.

Om verontreiniging door organische verbindingen te behandelen, worden momenteel bioremediatietechnologieën die micro-organismen gebruiken, aangemoedigd ¹. Alkanen zijn de meest voorkomende familie van koolwaterstoffen in ruwe olie, met 5 tot 40 koolstofatomen per molecuul ^{7, 21}. Veel bacteriën zijn bekend om het afbreken van alkanen van verschillende lengtes via sequentiële oxidatie van de terminale methylgroep waarbij eerst alcoholen, vervolgens aldehyden en uiteindelijk vetzuren worden gevormd ⁸. Binnen dit iGEM-project werden verschillende enzymen van verschillende organismen tot expressie gebracht en gekarakteriseerd, en beschikbaar gesteld via de BioBrick-standaard en Registry of Standard Biological Parts.

Het goed bestudeerde alkaan hydroxylase systeem van Gordonia sp. TF6 vergemakkelijkt de initiële oxidatiestap van C₅-C₁₃ alkanen samen met die van C₅-C₈ cycloalkanen met behulp van minimaal vier componenten: alkB2 (alkaan 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (twee rubredoxins) en RubB (rubredoxin reductase) ^{8, 21}. Oxidatie van lange-keten alkanen (variërend van C₁₅ tot C₃₆) wordt gerapporteerd als uitgevoerd door ladA, een flavoproteïne alkaan monooxygenase van Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 ^{7, 15, 18, 22}. LadA vormt een katalytisch complex met flavine mononucleotide (FMN) dat atomair zuurstof gebruikt voor oxidatie. Dit resulteert in de omzetting van alkanen in de overeenkomstige primaire alkanol. De alcoholen worden verder geoxideerd door alcohol en aldehyde dehydrogenases tot vetzuren, die gemakkelijk de β-oxidatieroute ingaan ^{7, 21}. Een zink-onafhankelijke alcohol dehydrogenase van de thermofiele bacterie Geobacillus thermoleovorans B23 oxideert middellange-keten alkanolen tot hun respectieve alkaanlen, met NAD⁺ als cofactor ¹⁰. Aldehyde dehydrogenase van dezelfde bacterie kan de NAD⁺-afhankelijke laatste stap in de middellange-keten oxidatie katalyseren ¹¹.

Om de inductiekosten te verlagen en de optimale proliferatie van het bacteriële systeem te behouden, werd de promotor pCaiF van E.coli gekarakteriseerd. Deze promotor kan de expressie van de koolwaterstoffabraakwegcomponenten reguleren en wordt gereguleerd door cAMP-Crp-niveaus, die op hun beurt afhankelijk zijn van glucoseniveaus ⁶. Bij hoge extracellulaire glucoseconcentraties in het milieu was het cellulaire cAMP (cyclische Adenosine Mononucleotide Fosfaat) niveau laag door de remming van adenylyl cyclase als een neveneffect van PTS-gemedieerde glucosetransport. Omgekeerd tijdens beperking (lage glucoseconcentraties) nam het cAMP-niveau toe en bond Crp aan cAMP waardoor het complex, cAMP-Crp, werd gevormd, dat pCaiF bond en de transcriptie van de downstream componenten activeerde ^{6, 14}.

Wildtype E. coli kan alleen matige concentraties van koolwaterstoffen verdragen. Om de toolkit compleet te maken, moest de tolerantie voor koolwaterstoffen worden aangepakt. Verschillende bacteriën die tolerant zijn voor organische oplosmiddelen zijn bekend om te overleven in tweefasige water-oplosmiddelsystemen ¹². Moleculaire componenten waarvan bekend is dat ze de tolerantie verhogen, zijn chaperones die de juiste vouwing van eiwitten vergemakkelijken. Het prefoldin-systeem van Pyrococcus horikoshii OT3, bestaande uit de eiwitten phPFDα en phPFDβ, bleek de koolwaterstoftolerantie te verhogen ¹⁷.

De alkaanconversie-toolkit werd geconstrueerd volgens het BioBrick-principe, dat is gedocumenteerd in het Registry of Standard Biological Parts ⁹. BioBricks zijn plasmiden die een specifiek functioneel insert bevatten dat wordt geflankeerd door 4 vooraf gedefinieerde restrictieplaatsen. De BioBrick-inserts kunnen flexibel worden uitgebreid, waardoor de constructie van biologische systemen met nieuwe functies mogelijk is.

Protocol

1. BioBrick Vergadering

1. BioBricks van de griffie van Standard Biological onderdelen worden geleverd door iGEM hoofdkwartier. In nieuw BioBrick van bestaande BioBricks construeren verteren de donor BioBrick (tot 1,0 ug) met de enzymen EcoRI en Spel voor het positioneren van de donor deel stroomafwaarts van de acceptor deel. Digest met XbaI en PstI voor het positioneren van de donor deel stroomopwaarts van het acceptor gedeelte. Voeg een derde geschikte restrictie-enzym dat knipt in de ruggengraat van de donor. Voer de digesties in een totaal volume van 20-25 ml met de juiste buffer, volgens de leverancier (eindconcentratie 1x). Gebruik 5 eenheden / ug DNA voor restrictie-enzymen.
2. Digereren van het acceptor BioBrick met ofwel EcoRI en Xbal en Spel en PstI.
3. Incubeer de vertering gedurende (ten minste) een uur bij 37 ° C. Inactiveren de restrictie-endonucleasen door warmte, incubatie bij 80 ° C gedurende 10 min en kort centrifuge.
4. Ligeren van het gedigereerde BioBrickdelen (donor en acceptor) samen. Aangezien XbaI en Spel genereren compatibel DNA-uiteinden, wordt een gemengde site gecreëerd die niet kunnen worden gesneden met een restrictie-enzym resulteert in een nieuwe gecombineerde 'BioBrick dat geflankeerd door de vier standaard restrictieplaatsen. In het ligatiemengsel de uiteindelijke DNA concentratie bij voorkeur ~ 100 ng / ul. Voer de ligatiereactie in een totaal volume van 10-15 ml met T4 ligatiebuffer (eindconcentratie 1x) en T4 ligase (1 eenheid / ug DNA).
5. Incubeer het ligatiemengsel bij 16 ° C gedurende ten minste 3 uur.
6. Voer transformatie reactie met circa de helft van het ligatiemengsel.
7. Bevestig de BioBrick juist te zijn met sequencing.
8. In nieuw te bouwen uit BioBrick gesynthetiseerd DNA, wijzigen de genen voor synthese voor optimale expressie in E. coli via de website JCat gereedschap ( http://www.jcat.de/ ). Verdere wijzigingen in overeenstemming met de vereisten van de B ioBrick standaard. Deze normalisatie impliceert dat elke BioBrick bestaat uit een DNA-sequentie van belang voorafgegaan door een prefix en gevolgd door een suffix. De prefix en suffix zijn sequenties die vooraf restrictieplaatsen, die afwezig zijn in de resterende plasmide volgorde bevatten. Deze standaard restrictieplaatsen maken het mogelijk om wisselen en flexibel uit te breiden de BioBrick inzetstukken ^9. Het voorvoegsel en achtervoegsel hebben de volgende sequenties:

Naam	Volgorde	Commentaar
Voorvoegsel	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	Als het volgende deel is een coderende sequentie of een deel dat begint met "ATG"
Achtervoegsel	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

ove_title "> 2. Alkane Conversie Resting Cell Assay, in vivo

Deze test werd uitgevoerd op basis van de methode beschreven door Fujii et al.. (2004).

1. Cultuur E. coli cellen die het alkaan Hydroxylase systeem ( BBa_K398014 ) en cellen die een lege vector ( BBa_J13002 ) in 5 ml LB medium met geschikte antibiotica nacht.
2. Breng 500 pi van de overnacht cultuur in 50 ml vers LB (met antibiotica) en incubeer de cel totdat troebelheid bereikt OD (optische dichtheid) van 0,3 bij 600 nm.
3. Centrifugeer gedurende 10 min bij 4.000 tpm en resuspendeer de pellet in 5 ml 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4).
4. Centrifugeer opnieuw gedurende 10 min bij 4.000 tpm en resuspendeer de pellet in 5 ml 0,1 M fosfaatbuffer nu met E2 zouten en 0,66% v / v glycerol (stikstof tekortkot medium).
5. Meet de cel troebelheid (OD _600).
6. Bereid cel-mengsel aliquots van 6 ml in 25 ml gesloten cap kolven en no-cell controles (E2 zouten + 0,66% v / v glycerol).
7. Voeg 100 nmol van alkaan aan elke kolf.
8. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 24 uur (verkorten bij hogere verkregen).
9. Meet de _OD600 na incubatie.
10. Pak de koolwaterstoffen in het kweekmedium door ethylacetaat en bepalen koolwaterstofconcentratie in celkweek met gaschromatografie (zie protocol 3).
11. Bereken de afbraak per eenheid biomassa door de totale hoeveelheid van alkaan omgezet door de totale biomassa aanwezig in elke kolf (converteren OD ₆₀₀ tot droog gewicht). Delen door de experimentele duur levert de afbraakactiviteit per eenheid biomassa per tijdseenheid. Het gemiddelde wordt genomen van drie individuele runs.

3. Alkaan Conversion Enzyme Assay, InVitro

Deze test werd in hoofdzaak uitgevoerd volgens de methode beschreven door Li et al.. (2008).

1. Cultuur E. coli cellen die het gen LADA ( BBa_K398017 ) en cellen die een lege vector ( BBa_J13002 ) in 50 ml LB medium met geschikte antibiotica nacht.
2. Breng 500 pi van de overnacht cultuur in 50 ml vers LB (met antibiotica) en incubeer de cel totdat troebelheid bereikt een optische dichtheid van 0,6 bij 600 nm.
3. Centrifugeer 10 minuten bij 4.000 rpm (4 ° C) en resuspendeer de pellet in 5 ml 50 mM Tris buffer.
4. Ultrasone trillingen (Cell disrupter, LA Biosystems) de cellen bij 40% inschakelduur met een vermogen controle van 4, houden van de oplossing op ijs voor de gehele duur.
5. Centrifugeer het resulterende mengsel gedurende 5 minuten bij 4000 rpm bij 4 & deg; C om de celresten te verwijderen. Breng het supernatant naar een nieuwe ampul.
6. Bepaal de totale eiwitconcentratie van de cel extracten van Bradford assay. Opmerking: Gebruik glazen flesjes aan de stijging van de achtergrond en / of verlies van eiwit te voorkomen.
7. Bereid een 100 ml mengsel dat 0,1% v / v alkaan en 50 mM Tris-HCl buffer.
8. Verwarm het mengsel bij 100 ° C gedurende 5 minuten. Opmerking: Voer deze stap alleen voor het midden-lange keten alkanen met een hoog kookpunt. (Bijvoorbeeld C _16: 287 ° C).
9. Om een ​​optimale oplosbaarheid van het alkaan bereiken ultrasone trillingen gedurende 1 min terwijl warm totdat een homogeen, viskeus mengsel verkregen.
10. Voeg 1 mM NADH, 1 mM FMN, 1 mM _MgSO4 en 0,01 v / v Triton X-100.
11. Bereid 6 ml porties in 25 ml gesloten cap kolven.
12. Voeg voldoende hoeveelheden celextract (afhankelijk van Bradford assays, eindconcentratie van 5 mg eiwit / l). Bereid een no-eiwit control.
13. Incubeer bij 60 ° C (voor optimale enzymatic activiteit) gedurende 24 uur.
14. Pak de koolwaterstoffen in het kweekmedium door ethylacetaat en bepalen koolwaterstofconcentratie in celkweek met gaschromatografie (zie protocol 3).
15. Bereken de afbraak per eenheid biomassa door de totale hoeveelheid van alkaan omgezet door totale eiwit toegevoegd aan elke kolf (door Bradford kalibratiekromme). Delen door verdere duur van het experiment levert de afbraakactiviteit per eenheid cellulair eiwit per tijdseenheid. Het gemiddelde wordt genomen van drie individuele runs.

4. Ethylacetaat koolwaterstoffen Extractie en concentratie metingen

1. Alkanen worden uit de waterige oplossing door toevoegen van 2,5 ml ethylacetaat (apolaire oplosmiddelvast) tot 6 ml experimentele oplossing. Een interne standaard wordt toegevoegd aan het oplosmiddel in een concentratie van 0,1% (v / v). De norm (bijv. cyclo-decaan) varieerde, afhankelijk van het verwachte bereik van de pieken van belang.
2. Optioneel: Voeg TritonX-100 aan het waterige mengsel en centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 4000 rpm om een ​​goede bi-fasisch systeem.
3. Vortex het mengsel gedurende 5 sec (1.500 rpm) en incubeer bij kamertemperatuur totdat de twee fasen gescheiden.
4. Verwijderen van een maximale hoeveelheid van de organische laag (boven) en droog oplosmiddel met watervrije magnesiumsulfaat.
5. Verwijder _MgSO4 door middel van filtratie (0,2 micrometer) en giet het filtraat in gaschromatograaf flesjes voor metingen, of bewaar bij -20 ° C.
6. Bepaal de concentratie gaschromatografie met een CP-SIL 5CB kolom (lengte = 5 m). Injecteer 10 pl monster in split mode (1:10, 230 ° C). Stel de kolom gasstroom 1 ml / min (Helium). De volgende oventemperatuur programma wordt gebruikt:

   Tarief	Temperatuur [° C]	Tijd [min]
   0	50	7,5
   50	90	1,0
   50	110	2,0
   50	130	2,0
   50	145	2,0
   50	160	2,0
   50	170	2,0
   50	185	2,0
   50	210	2,0
   50	250	2,0
   50	320	2,0

7. Integreren pieken en corrigeren concentraties ten opzichte van de interne standaard.

5. Alcohol / aldehyde dehydrogenase activiteit Assay

Deze test werd in hoofdzaak uitgevoerd volgens de methode beschreven door Kato et al..(2010).

1. Cultuur E. coli cellen die het ADH ( BBa_K398018 ) of ALDH ( BBa_K398030 ) gen en cellen die een lege vector ( BBa_J13002 ) in 50 ml LB medium met geschikte antibiotica nacht.
2. Breng 500 pi van de overnacht cultuur in 50 ml vers LB (met antibiotica) en incubeer de cel totdat troebelheid bereikt een optische dichtheid van 0,6 bij 600 nm.
3. Centrifugeer 10 minuten bij 4000 rpm bij 4 ° C en resuspendeer de pellet in 5 ml 50 mM Tris buffer.
4. Sonificeer de cel-oplossing bij 40% inschakelduur met een vermogen controle van de 4 (houd de oplossing op ijs tijdens de ultrasoonapparaat).
5. Centrifugeer het resulterende mengsel gedurende 5 minuten bij 4000 rpm bij 4 ° C verwijderen van celresten.
6. Te bepalental eiwitconcentratie van de cel extracten van Bradford assay (Opmerking: Gebruik een glazen flesje van eiwitbinding te voorkomen).
7. Plaats een 96 well plaat met 180 ul 57 mM glycine buffer die NAD (eindconcentratie 1 mM, pH 9,5) in elk putje.
8. Voeg 5 ul van de alcohol (aldehyde) worden getest om de putjes. Opmerking: Heat langketenige alcoholen voor het begin van de assay een vloeistof. Voor elke alcohol (aldehyde) een controle zonder substraat moet worden toegevoegd (negatieve controle). Bovendien een blanco die een mengsel van buffer en het substraat zonder celextract.
9. Verwarm de plaat van de plaatlezer (Tecan Magellan v7.0) gedurende 15 min bij 37 ° C tot evenwicht van het systeem mogelijk.
10. Voeg voldoende hoeveelheden celextract (afhankelijk van Bradford assays, eindconcentratie van 5 mg eiwit / l). Bereid een no-eiwit control.
11. Meet de NADH productie met een spectrofotometer bij een golflengte van 340 nm elke 2-3 min gedurende 1 uur bij 37 ° C.
12. Bereken de NADH productiesnelheid van de helling van de OD (340 nm). Houd rekening met het licht weglengte en de extinctiecoëfficiënt van NADH van 6220 M ^-1 cm ^-1. Verdeel het NADH productiesnelheid van de totale hoeveelheid eiwit toegevoegd aan de dehydrogenase activiteit van de reactie in de cel extract (U / mg celeiwit geheel) expressie. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs.

6. pCaiF Karakterisering

1. Cultuur E. coli-cellen die de pCaiF-GFP construct ( BBa_K398331 ) en cellen die de promotor alleen ( BBa_K398326 ) 's nachts in 5 ml LB-medium de juiste antibiotica' s nachts.
2. Inoculeer 5 ml M9 met 10 g / l glucose en antibiotica met 50 ul van de nachtkweek en groeien overnacht.
3. Subcultuur 50 ul van de overnight uitgroei in 5 ml vers M9 bij 10 g / l en incubeer de cel totdat troebelheid bereikt een optische dichtheid van 0,2 bij 600 nm.
4. Plaats een plaat met 96 putjes met 100 pl vers M9 medium met de gewenste hoeveelheid koolstofbron voor het testen in elk putje. Voer triplo uitgevoerde experimenten voor statistische evaluatie en voeg de respectieve negatieve controles (wild-type E. coli K12).
5. Voeg 5 ul van de kweek gedurende de nacht op de informatiedrager putjes.
6. Meet de groeicurve (OD ₆₀₀₎ en GFP-fluorescentie (excitatie 485 nm en emissie 520) met een plaatlezer elke 10 minuten gedurende 18 uur bij 37 ° C onder constant schudden.
7. Bereken de groeisnelheid en de specifieke GFP inhoud van de respectievelijke metingen en vergeleken met de controle. Bereken het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste drie onafhankelijke experimenten.

7. Tolerantie Assay

1. CultuurE. coli expressie PhPFDα en β gen ( BBa_K398406 ) overnacht in 5 ml LB medium en de juiste antibiotica. E. coli expressie LADA gen ( BBa_K398017 ) gebruikt als negatieve controle.
2. Subcultuur 10 ul van het overnight uitgroei in vers 5 ml LB (met antibiotica) en incubeer de cel totdat troebelheid bereikt een optische dichtheid van 0,3 tot 0,4 bij 600 nm.
3. Verdun de culturen met vers medium tot een OD ₆₀₀ van 0,1 is bereikt.
4. Plaats een 96 well plaat met 180 ul M9 medium met de geschikte antibiotica en de juiste uiteindelijke concentratie van de giftige verbinding (bv. 0, 4, 8, 10% n-hexaan) in drievoud. Omdat alkaan-water mengsels kan leiden tot tweefase systemen is het essentieel om toepasselijke controles op de plaat (bijvoorbeeld dAllerlei mensen melden stammen en de respectieve blanco experimenten).
5. Voeg 20 ul van de cultuur (controle) in de putjes.
6. Meet de biomassaconcentratie (OD ₆₀₀₎ met een plaatlezer elke 10 min gedurende 24 uur bij 37 ° C onder constant schudden.
7. Bereken de groei van de respectievelijke metingen voor de verschillende concentraties en middel te vergelijken met de negatieve controle. Bereken het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste drie onafhankelijke runs.

8. Homoloog Interactie Mapping

1. De applicatie HIM is ontwikkeld om eiwit queries uit te voeren op een PostgreSQL server waarop de STRING-database (gratis voor academisch gebruik) ^20. De homoloog interactie mapping applicatie identificeert interagerende eiwitten in de oorspronkelijke gastheer organisme met behulp van de STRING-database. De sequenties van de respectieve genen interactie worden gebruikt in een BLAST zoekopdracht homologe genen in het doelorganisme vinden. Cytoscape ⁴ wordt gebruikt om het resultaat van de mapping visualiseren. De HIM software tool kan worden gedownload op: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. Om een mapping uit te voeren, (1) Voer de BioBrick ID en de applicatie zal automatisch downloaden van de deel sequence data van de griffie van Standard Biological Parts ^9, of (2) enter (plakken) de sequence data in de applicatie.
3. Gebruik de STRING Database website om de STRING eiwit-ID voor de ingevoerde aminozuursequentie te vinden.
4. Een eiwit met hoge homologie wordt bepaald met BLAST. Vervolgens geeft de toepassing elke bekende interagerende proteïne in het bronorganisme en zoekt homologen in het gastheerorganisme (bijv. E. coli).
5. Uitvoer die voortvloeit vermeende interactie lijst om tekst of Cytoscape.

Resultaten

Alkane-omzetting

De activiteit van de drie oxidatie-stappen van het alkaan tot de respectieve vetzuur werd geëvalueerd met behulp van rustende celtests en enzymactiviteitsmetingen. De resultaten worden gepresenteerd volgens de padreacties (1) alkaan hydroxylase, (2) alcohol dehydrogenase en (3) aldehyde dehydrogenase.
Voor de eerste stap werden verschillende plasmiden geconstrueerd voor middellange en lange keten alkanen. Het plasmide

Discussie

De BioBrick principe wordt gebruikt om een ​​chassis voor de afbraak van alkanen bouwen en een bewijs van principe voor de afzonderlijke componenten van de toolkit verkregen. Verschillende assays voorgesteld om de in vivo en in vitro activiteit van alkaan afbrekende enzymen route. De gepresenteerde werk toont succes een aantal methoden die kunnen worden gebruikt om enzymactiviteiten en expressie in het gastheerorganisme E. bepalen coli na implementatie van geschikte BioBricks. Verder ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octaan	Fluka	74822
Hexadecaan	Fluka	52209
octanol-1	Fluka	95446
dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexaan	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 ligase	New England Biolabs	M0202L
Gas chromatograph
Cell disrupter	LA Biosystems	CD-019
Spectrofotometer	Amersham pharmacia	spec 2000
Plate reader	Tecan Group Ltd.	Magellan v7.0
Incubator	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398014	Alkaan hydroxylase systeem Weerstand: Chlooramfenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398027	ladA Eiwit Generator Weerstand: Chlooramfenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398018	ADH generator Weerstand: Chlooramfenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398030	ALDH generator Weerstand: Chlooramfenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398326	pCaiF promotor Weerstand: Chlooramfenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398331	pCaiF meetapparaat Weerstand: Chlooramfenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107-	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398406	Solvent tolerantie cluster Weerstand: Chlooramfenicol