Een duurzame auto regelen van bacterieel systeem voor de sanering van olieverontreinigingen werd ontworpen met behulp van standaard verwisselbare DNA delen (BioBricks). Een aangelegde E. coli Stam werd gebruikt om alkanen via β-oxidatie afgebroken in toxische waterige omgevingen. De respectieve enzymen van verschillende soorten toonde alkaan degradatie activiteit. Daarnaast werd een verhoogde tolerantie voor N-Hexaan werd bereikt door genen van alkaan-tolerante bacteriën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een toolkit voor de omzetting van koolwaterstoffen inschakelen in waterige milieus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit werk voert een toolkit die de omzetting van alkanen in staat stelt door Escherichia coli en presenteert een proof of principle van de toepasbaarheid. De toolkit bestaat uit meerdere standaard verwisselbare onderdelen (BioBricks) 9 aanpakken van de omzetting van alkanen, regulatie van genexpressie en overleving in toxische koolwaterstof-rijke omgevingen.
Een drie-stap route voor alkaan afbraak werd in E. coli de omzetting van middellange-en lange-keten alkanen hun respectieve alkanolen, alkanalen en uiteindelijk alkaanzuren-zuren toestaat. Zij werden omgezet via het natieve β-oxidatie pathway. De oxidatie van middellange-keten alkanen (C5-C13) en cycloalkanen (C5-C8), vier genen (alkB2, rubA3, rubA4 en Rubb) van het alkaan hydroxylase systeem Gordonia sp vergemakkelijken. TF6 8,21 werden getransformeerd in E. coli. Voor de omzetting vanlangketenige alkanen (C15-C36), werd het gen van Lada Geobacillus thermodenitrificans uitgevoerd. Voor de vereiste verdere stappen van het afbraakproces, werden ADH en ALDH (afkomstig van G. thermodenitrificans) geïntroduceerd 10,11. De activiteit werd gemeten door rustende cel assays. Voor elke oxidatieve stap, werd de enzymactiviteit waargenomen.
Om het proces te optimaliseren, werd de expressie geïnduceerd onder enige laag glucose omstandigheden: een substraat gereguleerde promoter, pCaiF, gebruikt. pCaiF aanwezig in E. coli K12 en de expressie van de genen betrokken bij de afbraak van niet-glucose koolstofbronnen.
Het laatste deel van de toolkit - targeting overleving - werd uitgevoerd met behulp van oplosmiddel tolerantie genen, PhPFDα en β, beiden uit Pyrococcus horikoshii OT3. Organische oplosmiddelen kunnen induceren cel stress en verminderde overlevingskansen door negatief affecting eiwit vouwen. Zoals chaperones, PhPFDα en β verbeteren eiwit vouwproces bijvoorbeeld in de aanwezigheid van alkanen. De expressie van deze genen geleid tot een verbeterde koolwaterstof tolerantie aangetoond door een verhoogde groeisnelheid (tot 50%) in de aanwezigheid van 10% n-hexaan in het kweekmedium waargenomen.
Samenvattend, de resultaten aan dat de E. toolkit kan coli te zetten en koolwaterstoffen tolereren in waterige omgevingen. Als zodanig is het is een eerste stap op weg naar een duurzame oplossing voor de olie-sanering met behulp van een synthetische biologie aanpak.
Inleiding
Olievervuiling behoort tot de ernstigste oorzaken van milieuverontreiniging en heeft een grote impact op ecosystemen, bedrijven en gemeenschappen 3. Er zijn bijvoorbeeld oplossingen nodig om de voortdurende olievervuiling uit de residuwateren van oliezand in Alberta, Canada, te bestrijden. Tijdens het proces van olie-extractie uit oliezand wordt bitumen, een semi-solide geoxideerde vorm van olie, verwijderd met behulp van thermische winningstechnieken die ongeveer 3,1 vaten water per enkel vat olie verbruiken 1. Met olie verontreinigd proceswater, dat hoofdzakelijk uit een lokale rivier komt, wordt na de bitumen-extractie opgeslagen in residubekk....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. BioBrick Vergadering
- BioBricks van de griffie van Standard Biological onderdelen worden geleverd door iGEM hoofdkwartier. In nieuw BioBrick van bestaande BioBricks construeren verteren de donor BioBrick (tot 1,0 ug) met de enzymen EcoRI en Spel voor het positioneren van de donor deel stroomafwaarts van de acceptor deel. Digest met XbaI en PstI voor het positioneren van de donor deel stroomopwaarts van het acceptor gedeelte. Voeg een derde geschikte restrictie-enzym dat knipt in de ruggengraat van de donor. Voer de digesties in een totaal volume van 20-25 ml met de juiste buffer, volgens de leverancier (eindconcentratie 1x). Gebruik 5 eenheden / ug DNA v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alkaanconversie
De activiteit van de drie oxidatiestappen van het alkaan naar het betreffende vetzuur werd geëvalueerd met behulp van rustende cel-assays en metingen van de enzymactiviteit. De resultaten worden gepresenteerd volgens de reacties van de route: (1) alkaanhydroxylase, (2) alcoholdehydrogenase en (3) aldehydedehydrogenase.
Voor de eerste stap werden verschillende plasmiden geconstrueerd voor middelketen- en langketenalkanen. Het plasmide
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De BioBrick principe wordt gebruikt om een chassis voor de afbraak van alkanen bouwen en een bewijs van principe voor de afzonderlijke componenten van de toolkit verkregen. Verschillende assays voorgesteld om de in vivo en in vitro activiteit van alkaan afbrekende enzymen route. De gepresenteerde werk toont succes een aantal methoden die kunnen worden gebruikt om enzymactiviteiten en expressie in het gastheerorganisme E. bepalen coli na implementatie van geschikte BioBricks. Verder .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De experimenten uitgevoerd in deze video-artikel zijn ontwikkeld voor de international Genetically Engineered Machine competitie 9. De auteurs danken iGEM teamleden Lucas Bergwerff, Pieter TM van Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Cueto Rojas en Ramon van der Valk voor de hulp bij het onderzoek. Wij danken Han de Winde, Stefan de Kok en Esengül Yıldırım voor nuttige discussies en het plaatsen van dit onderzoek. Dit werk werd ondersteund door de TU Delft Universiteit afdeling Biotechnologie, De Delftse Bioinformatics lab, TU Delft afdeling Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), StuD studentenuitzendbureau, Nederland Genomics Initiative, Kluy....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| E. coli K12 | New England Biolabs | C2523H | |
| Octaan | Fluka | 74822 | |
| Hexadecaan | Fluka | 52209 | |
| octanol-1 | Fluka | 95446 | |
| dodecanol-1 | Sigma-Aldrich | 126799 | |
| Hexaan | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| NADH | Sigma-Aldrich | N4505 | |
| FMN | Sigma-Aldrich | F2253 | |
| MgSO4 | J.T. Baker Casno | 7487 889 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| T4-ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Gaschromatograaf | |||
| Celdisrupteor | LA Biosystems | CD-019 | |
| Spectrofotometer | Amersham Pharmacia | spec 2000 | |
| Platenlezer | Tecan Group Ltd. | Magellan v7.0 | |
| Incubator | Innova, 44 | ||
| BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB | Technische Universiteit Delft bij de vakgroep Biotechnologie of het Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398014 | Alkaanhydroxylasesysteem Resistentie: Chloramfenicol |
| BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA | Technische Universiteit Delft bij de afdeling Biotechnologie of het Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398027 | ladA-proteïnegenerator Resistentie: chloramfenicol |
| BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH | Technische Universiteit Delft bij de afdeling Biotechnologie of Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398018 | ADH-generator Resistentie: Chlooramphenicol |
| BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH | Delft University of Technology bij de afdeling Biotechnologie of Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398030 | ALDH-generator Resistentie: Chloramphenicol |
| BioBrickTM K398326: pCaiF | Technische Universiteit Delft bij de vakgroep Biotechnologie of het Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398326 | pCaiF-promotor Resistentie: Chloramfenicol |
| BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401 | Technische Universiteit Delft bij de vakgroep Biotechnologie of Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398331 | pCaiF-meetapparaat Resistentie: Chloramfenicol |
| BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- | Delftse Universiteit van Technologie bij de afdeling Biotechnologie of Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398406 | Oplosmiddeltolerantiecluster Resistentie: Chlooramphenicol |
Referenties
- Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
- Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological C....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
