Zuivering en Aggregatie van het amyloïde voorlopereiwit intracellulaire domein

Samenvatting

Werkwijze voor grootschalige zuivering van het APP intracellulaire domein (AICD) beschreven. We beschrijven ook de methodologie voor het induceren In vitro AICD aggregatie en visualisatie van atomaire kracht microscopie. De beschreven methoden zijn nuttig voor biochemische / structurele karakterisering van de AICD en de effecten van moleculaire chaperones op de aggregatie.

Samenvatting

Amyloïde voorlopereiwit (APP) is een type I transmembraan eiwit geassocieerd met de pathogenese van de ziekte van Alzheimer (AD). APP wordt gekenmerkt door een groot extracellulair domein en een korte cytosolische domein zogenaamde APP intracellulaire domein (AICD). Tijdens rijping door de secretieroute kan APP worden gesplitst door proteasen genoemd α, β, γ-en secretasen ^1. Sequentiële proteolytische splitsing van APP met β en γ-secretasen leidt tot de productie van een kleine proteolytische peptide, aangeduid Aß, dat amyloidogene en de kern bestanddeel van seniele plaques. De AICD is bevrijd van het membraan na secretase verwerking en via interacties met Fe65 en Tip60 kan naar de kern om aan transcriptie regulatie van meerdere doelgenen ^2,3. Eiwit-eiwit interacties waarbij AICD kunnen beïnvloeden handel, verwerking en cellulaire functies van holo-APP en C-terminal fragmenten. We hebben onlangs aangetoond dat AICD kan totaal in vitro, en dit proces wordt geremd door de AD-betrokken moleculaire chaperonne ubiquilin-1 ^4. Consistent met deze bevindingen de AICD hydrofobe domeinen heeft belicht en intrinsiek ongeordend in vitro ^5,6, maar het verkrijgt stabiele secundaire structuur wanneer gebonden aan Fe65 ^7. We hebben voorgesteld ubiquilin-1 ongepast inter-en intramoleculaire interacties van AICD voorkomt, waardoor aggregatie in vitro en in intacte cellen ^4. Terwijl de meeste studies richten zich op de rol van APP in de pathogenese van AD, de rol van de AICD in dit proces is niet duidelijk. Expressie van AICD is aangetoond dat apoptose induceren ^8, te moduleren signaalwegen ^9, en calcium reguleren signalering ^10. Over-expressie van AICD en Fe65 in een transgeen muismodel induceert Alzheimer pathologie zoals ¹¹ en onlangs AICD is gedetecteerd in brain lysaten door western blotting, wanneer er gebruik geschikte antigeen retrieval technieken ^12. Structurele, biochemische en biofysische studies van AICD vergemakkelijken, hebben we een procedure om recombinant grote hoeveelheden zeer zuivere eiwit AICD. We beschrijven verder een werkwijze voor het induceren van de in vitro aggregatie van thermische analyse door AICD en atomic force microscopie. De beschreven methoden zijn nuttig voor biochemische, biofysische en structurele karakterisering van de AICD en de effecten van moleculaire chaperones op AICD aggregatie.

Protocol

1. Expressie van recombinant APP intracellulaire domein (AICD)

1. Transform E. coli-stam BL21 met menselijke AICD (resten 649 tot 695 van APP, neuronale isovorm nummering) gekloneerd in vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Deze vector uitdrukkelijke AICD het C-terminale deel van een fusie-eiwit van glutathion-S-transferase (GST). Deze vector codeert ook trombine splitsingssequentie om loskomen van de GST eenheid. Details van het klonen AICD in pGEX-4T-1 kan worden gevonden in onze vorige publicatie ^4.
2. Van een enkele kolonie inoculeren van 10 ml LB-bouillon met ampicilline (100 ug / ml), en incubeer overnacht bij 37 ° C met krachtig schudden.
3. De volgende ochtend inoculeren 400 ml LB / ampicilline in een een-liter kolf met 5 ml van de overnacht kweek.
4. Incubeer bij 37 ° C met krachtig schudden totdat de optische dichtheid bij 600 nm is bereikt 0,4 tot 0,6. Dit zal normaal duurt 2 tot 2,5 uur.

content "> Op dit punt kan het wenselijk om uit een klein monster (~ 10 pi) om de zuivering te volgen door SDS-PAGE (zie figuur 1A, B). Elke volgende zuiveringsstap ook een kleine hoeveelheid verwijderd voor analyse door SDS-PAGE.

5. Induceren expressie van GST-AICD door toevoeging van 0,4 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Incubeer bij 37 ° C met krachtig schudden gedurende 5 uur.
6. Centrifugeer de cellen bij 6000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. De celpellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele maanden op dit punt van de procedure.

2. Zuivering van GST-AICD

1. Bereid 50 ml lysis buffer als volgt: 1 mM dithiothreitol, 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), Complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science) en fosfaat gebufferde zoutoplossing. Chill op ijs.
2. Ontdooi bacteriële pellet (als dit eerder bevroren) opijs.

Op dit punt is het essentieel dat alle stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C voor proteolyse beperken. Alle buizen, buffers en andere reagentia moeten voorgekoeld. Bij gebruik van een Franse pers of emulgator voor lysis, moeten deze voorgekoeld ook.

3. Grondig resuspendeer de bacteriële pellet in 20 ml lysisbuffer. Een combinatie van vortexen en trituratie met 10 ml pipet op ijs zorgt volledig resuspenderen van de pellet.
4. Langs de geresuspendeerde bacteriecellen via een emulgator (bijvoorbeeld Avestin EmulsiFlex-C3) of French drukcel, voorgekoeld tot 4 ° C bij 30.000 psi. Steek de lysaat door de emulgator een tweede keer. Verzamel het lysaat in een voorgekoeld 50 ml tube.

Het belangrijkste voordeel van deze twee instrumenten is dat ze minimaliseren verhitting van het monster. De gebruikte techniek van sonificatie genereert veel warmte aan het uiteinde van de probe en sonicatiekan leiden tot aggregatie van recombinant eiwitten.

5. Centrifugeer het lysaat bij 15.000 xg gedurende 30 minuten. Scheiden en houden de supernatant in een voorgekoeld 50 ml tube.
6. Voeg 500 ul van een 50% suspensie van glutathion-agarose (Sigma-Aldrich). Draai gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Terwijl het monster draait, vers maken elutiebuffer: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM dithiothreitol, 10 mM gereduceerd glutathion.

De enige stap van het protocol dat wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur is de elutiestap. Aldus wordt de elutiebuffer op kamertemperatuur. Elutiebuffer moet vers worden bereid.

7. Giet het lysaat en slurry in een wegwerp 5 "polystyreen chromatografiekolom met grove (90-130 urn) filters (Evergreen Scientific). Was de kolom 5 maal met 3 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing.
8. Dop op de bodem van de kolom en voeg 500 ul elutiebuffer kamertemperatuur. Dop op de bovenzijde van dekolom en draaien gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Vang het eluaat op in een gekoeld 1,5 ml microfugebuis. Herhaal de elutie twee keer (1,5 ml totaal eluaat).
9. Dialyseer het eluaat in een 10.000 molecuulgewicht cutoff dialysemembraan (bijvoorbeeld Thermo Scientific Slide-A-Lyzer dialyse cassettes) in 4 liter fosfaat gebufferde zoutoplossing overnacht bij 4 ° C. Dialyseer tegen extra 4 liter fosfaat gebufferde zoutoplossing bij 4 ° C gedurende 1 uur de volgende dag.
10. Verwijder het eiwit van de dialyse cassette en voer een eiwit kwantificering assay om de opbrengst van GST-AICD bepalen. Een typische zuivering uit 400 ml cultuur zal resulteren in een opbrengst van> 20 mg gezuiverd eiwit in concentraties van 10-20 mg / ml. Aliquot het eiwit in 200 ul aliquots en invriezen bij -80 ° C.

3. Splitsing van GST trombine-AICD en zuivering van AICD

1. Thaw 200 ul van gezuiverd GST-AICD en voeg 20 ul 1 U / ul Thrombin overnacht incuberen bij 37 ° C.

De kwaliteit en zuiverheid van trombine varieert aanzienlijk tussen fabrikanten en kan een belangrijke bron van verontreiniging. We maken gebruik van trombine door GE Healthcare (zie tabel van de reagentia). Na overnacht incubatie moet> 95% van het fusie-eiwit worden gesplitst (figuur 1B).

2. Na overnacht splitsing met trombine, is het waarschijnlijk dat een fractie van het vrijgemaakte AICD aggregatie ondergaan en de oplossing lijkt troebel. Verwijder de verzamelde materiaal door centrifugeren bij 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant in een voorgekoeld microfugebuis.
3. Voeg 50 ul van 50% glutathion-agarose slurry en 50 pi 50% p-aminobenzamidine-agarose slurry aan GST en trombine te verwijderen, resp. Incuberen met rotatie gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
4. Centrifugeer kort sediment de agarosekorrels, en verwijder het supernatant in een nieuwe buis. Extract tGST hij vier keer met glutathion-agarose. Een extractie met p-aminobenzamidine-agarose voldoende is om de 20 U van trombine te verwijderen.
5. Voer een eiwit kwantificatie assay op 5 ul van het gezuiverde AICD. Typische opbrengsten van 400 ml cultuur 50-100 ug in een concentratie van 0,2 tot 0,5 mg / ml. Hogere opbrengsten zijn mogelijk door het splitsen van grotere volumes van GST-AICD.

Gezuiverd AICD moet vers worden bereid voor de biochemische / biofysische karakterisering. Ongebruikt materiaal moet worden weggegooid. Het is ook mogelijk de AICD concentreren door vriesdrogen van het monster en opnieuw suspenderen in een kleiner volume van buffer ^6. Als detecteren AICD heeft blotting (zoals na een val of filter dot blot assay), antigenen op het membraan worden uitgevoerd zoals beschreven door Pimplikar en Suryanarayana ^12.

4. AICD Aggregatie voor Atomic Force Microscopy (AFM)

1. Verdun vers bereide AICD in phosphate gebufferde zoutoplossing tot een concentratie van 0,1 mg / ml in een eindvolume van 15 pi. Op dit punt kunnen verschillende verbindingen en / of eiwitten worden toegevoegd om te bepalen of ze remmen AICD aggregatie. Zo hebben we aangetoond dat equimolaire concentraties van ubiquilin-1 aggregatie van AICD voorkomen in deze assay ^4.

Het is ook mogelijk om grotere totale reactievolumes voor biochemische experimenten zoals filter trap assays en lichtverstrooiing ^4. We hebben succes gehad uitvoeren filter trap assays op reactiemengsels zo groot als 400 ul met AICD verdund tot concentraties van 1 uM.

2. Induceren thermische aggregatie door incubatie van de monsters bij 43 ° C onder schudden bij 800 rpm in een Eppendorf Thermomixer gedurende 48 uur. Deze temperatuur werd gekozen op basis van chaperone assays die de thermische aggregatie van het model chaperone substraat citrate synthase ^4,13 onderzoeken.

Thermal aggregatie is een veelgebruikte methode om de structurele overgang van een eiwit induceren van een afkomstig uit een niet-natieve structuur (meestal beta sheet rijk) leidt tot de vorming van intermoleculaire aggregaten. Thermische aggregatie wordt ook gebruikt om de functie van moleculaire chaperones, die hydrofobe segmenten afschermen van die ongepast intermoleculaire interacties (en dus vertragen of voorkomen thermische aggregatie) onderzoeken.

3. Verdun het monster 20 maal in gedemineraliseerd water en 2 ui spot op vers gekloofd mica. Droog het monster in een exsiccator 's nachts. Het zal nodig zijn om empirisch de optimale verdunning voor beeldvorming en dus verschillende verdunningen variërend van 10 - tot 100-voudig verstandig zou zijn.
4. Visualiseer de geaggregeerde AICD met behulp van de AFM die in tapping mode ^14. De gebruikte uitkragingen zijn goud gecoate micro scherpe nitride hendels (MSNL, Bruker) met een nominale tip straal van 2 nm. Typische tikken amplitudes tijdensing imaging zijn 10-20 nm bij de resonantiefrequentie van de cantilevers (30-50 kHz).

We vonden dat de beeldkwaliteit en contrast van verschillende eiwitaggregaten afhankelijk van de uitgeoefende kracht en de duur van het experiment. Om monster verstoring te minimaliseren door de tip, we onderhouden de uitgeoefende kracht relatief laag door het houden van een set-point-ratio boven de 95% en het beperken van het scannen van elk monster tot 5-10 minuten. Beeldverwerking werd uitgevoerd met WSxM software (Nanotec). Standaard beeldverwerking bestond uit het vliegtuig aftrekken en afvlakking. Onze laboratoria gebruiken een "home-built" AFM ¹⁵ gekoppeld aan een commerciële scanning probe microscoop systeem (Nanotec).

5. Representatieve resultaten

De expressie en relatieve verrijking van GST-AICD wordt getoond in figuur 1A. Na lysis, het merendeel van het fusie-eiwit in de oplosbare fractie en dus extractie uit inclusiop organen niet nodig. Het materiaal geëlueerd van de glutathion agarose kolom> 95% zuiver. Bij de bereiding figuur 1, de eiwitconcentratie van de kolom geëlueerd was 14,5 mg / ml, en de opbrengst was 22 mg (van een beginnend cultuur van 400 ml). Splitsing van 200 ul van dit preparaat een nacht met 20 U van trombine resulteerde in bijna 100% splitsing van het fusie-eiwit (Figuur 1B). De hoeveelheid trombine die laag genoeg is om niet detecteerbaar door Coomassie blauw kleuring (zie "gekliefde" lane, Figuur 1B). Verwijdering van het trombine en GST resulteerde in een verlies van materiaal, maar het was> 90% zuiver met een opbrengst in deze prep van 70 ug AICD bij een concentratie van 0,35 mg / ml. Figuur 1C toont het stroomschema voor aggregatie van AICD en daaropvolgende analyse. AICD aggregaten afgebeeld door AFM zijn typisch bolvormige / amorf, en variëren in grootte van 50 tot 100 nm (figuur 1D, F). Geaggregeerdemateriaal niet detecteerbaar wanneer een equimolaire hoeveelheid van de chaperone ubiquilin-1 toegevoegd aan de aggregatie reactie (Figuur 1E) ^4.

Figuur 1. Zuivering en aggregatie van AICD. A) Coomassie blauwe kleuring van monsters bij elke stap van het zuiveringsproces. Voor de niet-geïnduceerde en geïnduceerde monsters werd 20 ul van de totale bacteriën uitgevoerd op de gel. Voor de supernatantfractie werden 5 ul lysaat (van een totaal volume van 20 ml) in het op gel. Voor de pelletfractie, de pellet werd geresuspendeerd in 20 ml lysisbuffer, en 5 ul van dit materiaal werden gesonificeerd in een badsonicator water gedurende 30 minuten bij 4 ° C voorafgaand aan het laden op de gel. De doorstroom werd 5 pl uitgevoerd op de gel. De hoeveelheid eluaat geladen op de gel zijn aangegeven. B) Coomassie blauw gekleurde gel van ongeknipt en gesplitst GST-AICD (2 pi) en 1 en 5 m &u; l gezuiverd AICD. C) Stroomschema van AICD zuivering, aggregatie en analyse. D, E) Vertegenwoordiger AFM afbeelding van thermisch geaggregeerd AICD in afwezigheid (D) en aanwezigheid (E) van het moleculaire chaperone ubiquilin-1. F) Histogram van de grootteverdeling van AICD aggregaten.

Discussie

In dit protocol hebben we geschetst van een procedure voor het verkrijgen van zeer zuivere AICD om structurele, biofysische en biochemische analyses. Deze procedure vereist geen geavanceerde chromatografie apparatuur en is daarom toegankelijk voor de meeste laboratoria. Andere groepen hebben gezuiverd AICD ^5-7,16, met inbegrip van GST-AICD ^17-19, voor de biochemische / structurele analyses. Nadelen naar de vorige protocollen zijn: een slechte oplosbaarheid van AICD ^16, minder dan ideaal ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
Trombine	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicilline	Fisher Scientific	BP1760
Bradford eiwittest reagens	Bio-Rad	500-0002
Coomassie blauw	Bio-Rad	161-0786
IPTG (isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutathion-agarose	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidine-agarose	Sigma-Aldrich	A7155
Volledige protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Slide-A-Lyzer dialyse cassettes	Thermo Scientific	66380
Chromatografiekolommen	Evergreen Wetenschappelijke	208-3367-050
Emulgator	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	Zeer aan te bevelen
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Mica schijven	Ted Pella	50 tot 12
AFM uitkragingen	Bruker	MSNL-10
WSxM software	Nanotec	N / A	Free downloaden