Cardiale kernen worden geïsoleerd via dichtheid sedimentatie en immunolabeled met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) te identificeren en cardiomyocyten kernen sorteren op flowcytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Identificatie van cardiomyocyten kernen is een uitdaging in het weefsel secties als de meeste strategieën vertrouwen op cytoplasmatische marker-eiwitten 1. Zeldzame gebeurtenissen in hartspiercellen zoals de proliferatie en apoptose vereisen een nauwkeurige identificatie van de cardiale myocyten kernen om celvernieuwing in de homeostase en in pathologische voorwaarden 2 te analyseren. Hier bieden we een methode om cardiomyocyt kernen te isoleren van post mortem weefsel door de dichtheid sedimentatie en immunokleuring met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) en de daarop volgende flowcytometrie sorteren. Deze strategie zorgt voor een hoge doorvoer analyse en isolatie met het voordeel van het werken even goed op verse en bevroren weefsel archiefmateriaal. Dit maakt het mogelijk te onderzoeken materiaal reeds verzamelde biobanken. Deze techniek is en getest in een groot aantal soorten en geschikt voor diverse toepassingen later zoals koolstof-14 datering 3 cel-cykel analyse 4, visualisatie van thymidine-analogen (bv. BrdU en IDU) 4, transcriptoom en epigenetische analyse.
Protocol
1. Isolatie van de Cardiac Kernen
- Coat ultracentrifuge buizen (Beckman centrifugebuizen # 363664) met 10 ml van 1% BSA / PBS coating oplossing. Cap de buizen en laten roteren gedurende 30 min in een buis rotator. Verwijder de coatingoplossing en laat de centrifugebuis drogen (een buis per muizenhart is voor de analyse van de muis hart, afwisselend tot 5 muizen hart of 1 g hartweefsel van een andere soort (bijv. humane) kunnen worden verwerkt in een buis).
- Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd op het ijs. Ontleden van de linker ventrikel van verse of snap-bevroren muis hart met een scalpel. Merk dit protocol geoptimaliseerd voor muizenhar....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Nauwkeurige identificatie van cardiomyocyt kernen is van cruciaal belang voor de analyse van regeneratieve processen in het myocard 2,3. Conventionele technieken voor cardiomyocyten van sel isoleren zijn hoofdzakelijk gebaseerd op enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix en de daaropvolgende zuivering van interstitiële cellen door centrifugeren lage snelheid. Verdere zuivering van levende cardiomyocyten van embryonale stamcellen (SER) kan worden uitgevoerd door immunokleuring met markers zoals Sirpa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We willen graag Marcelo Toro erkennen voor de hulp bij flowcytometrie. Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Hart-en Long Foundation, EU-Commissie KP7 "CardioCell", Zweedse Raad voor Onderzoek, AFA verzekeringen en ALF. OB werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1. Lysisbuffer | |||
| Naam van het serum | |||
| 0,32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesiumacetaat | |||
| 2,0 mM EDTA | |||
| 0,5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT |
| 2. Sucrose buffer |
|---|
| Naam van het serum |
| 2.1 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM magnesiumacetaat |
| 1 mM DTT |
| 3. Kernen opslagbuffer (NSB plus) |
|---|
| Naam van het serum |
| 0,44 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) |
| 70 mM KCl |
| 10 mM MgCl2 |
| 1,5 mM spermine |
| Reagentia en apparatuur | Vennootschap |
|---|---|
| Isotype konijnen-IgG-CHIP Grade, # ab37415 | Abcam |
| Konijn anti-PCM-1 antilichaam, # HPA023374 | Atlas Antilichamen |
| Donkey sec. antilichaam, anti-konijn Alexa Fluor 488, # A-21206 of een gelijkwaardige sec. fluorescentie-antilichaammethode | Life Technologies |
| DRAQ5 | Biostatus |
| cell filters 30 pm, 70 pm en 100 pm | BD Biosciences |
| Glas douncer (40 ml) enstamper "L" | VWR (Wheaton Industries Inc) |
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Duitsland |
| Dispergeren hulpmiddel S25 N-18 G | IKA Duitsland |
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
| Falcon Buizen 15 ml en 50 ml | VWR |
| Beckman Centrifugebuizen # 363664 | Beckman Coulter |
| JS13.1 gratis swingende rotor | Beckman Coulter |
| Instroom cytometer | Beckman Coulter |
| Tube Rotator | VWR |
Referenties
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
