Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Summary

Een nieuwe methode gerichte evolutie eigen aan de thermostabiliteit van techniek is ontwikkeld en dus gevalideerd voor bacteriolytische enzymen. Na een ronde van willekeurige mutagenese, een geëvolueerd bacteriolytische enzym PlyC 29C3, weergegeven groter is dan tweemaal de restactiviteit in vergelijking met het wild-type eiwit na incubatie verhoogde temperatuur.

Abstract

Gerichte evolutie wordt gedefinieerd als een methode om natuurlijke selectie benutten om eiwitten engineering bijzondere eigenschappen die niet worden geassocieerd met het eiwit in de natuur verwerven. Literatuur heeft talloze voorbeelden met betrekking tot de uitvoering van de gerichte evolutie om met succes te veranderen moleculaire specificiteit en katalyse ^1. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van gerichte evolutie plaats van rationelere benaderingen voor moleculaire technologie betreft de omvang en diversiteit van varianten die kunnen worden gescreend ^2. Een mogelijke toepassing van gerichte evolutie omvat het verbeteren van de structurele stabiliteit van bacteriolytische enzymen, zoals endolysines. Bacteriofaag coderen en expressie endolysines een kritische covalente binding in de peptidoglycan (ie celwand) van bacteriën hydrolyseren, waardoor gastheercel lysis en bevrijding van virusdeeltjes. Met name deze enzymen bezitten het vermogen om extrinsiek induceren lysis te susceptbaar bacteriën in afwezigheid van faag en bovendien zijn gevalideerd zowel in vitro als in vivo voor hun therapeutisch potentieel ^3-5. Het onderwerp van gerichte evolutie studie betreft de PlyC endolysine, die bestaat uit PlyCA en PlyCB subeenheden ^6. Wanneer gezuiverd en extrinsiek toegevoegd, PlyC holoënzym lyseert streptokokken van groep A (GAS) en andere groepen streptokokken in enkele seconden en bovendien is gevalideerd in vivo tegen GAS ^7. Opmerkelijk controle van rest enzymkinetiek na incubatie verhoogde temperatuur levert duidelijk bewijs dat PlyC lytische activiteit abrupt verliest bij 45 ° C, hetgeen een korte therapeutische houdbaarheid die extra ontwikkeling van dit enzym kan beperken. Verdere studies blijkt het gebrek aan thermische stabiliteit alleen waargenomen voor de PlyCA subeenheid, terwijl de PlyCB subeenheid is stabiel tot ~ 90 ° C (niet gepubliceerde waarneming). Naast PlyC zijn er several voorbeelden in de literatuur dat de thermolabiele aard van endolysines beschrijven. Bijvoorbeeld het Staphylococcus aureus endolysine LysK en Streptococcus pneumoniae endolysines Cpl-1 en Pal spontaan kunnen verliezen bij 42 ° C, 43,5 ° C en 50,2 ° C respectievelijk ^8-10. Volgens de Arrhenius vergelijking, die de snelheid van een chemische reactie betrekking op de temperatuur in het specifieke systeem, zal een verhoging van de thermostabiliteit correleren met een toename shelf levensverwachting ^11. Met dit doel is directed evolution blijkt een nuttig instrument voor wijziging van de thermische activiteit van verschillende moleculen in de natuur, maar nooit deze bijzondere technologie met succes benut voor de studie van bacteriolytische enzymen. Ook succesvolle rekeningen van voortgang van de structurele stabiliteit van deze specifieke klasse van antimicrobiële middelen in totaal zijn onbestaande. In deze video maken we gebruik van een nieuwe methodologie die een fout-pr gebruikteen DNA polymerase gevolgd door een geoptimaliseerde screening met behulp van een microtiterplaat met 96 putjes format tot mutaties identificeren de PlyCA subeenheid van het PlyC streptokokken endolysine die correleren met een toename enzym kinetische stabiliteit (Figuur 1). Resultaten na een ronde van willekeurige mutagenese suggereren de methodiek PlyC varianten die meer dan tweemaal de residuele activiteit behouden ten opzichte van wild-type (WT) PlyC na verhoogde temperatuur behandeling genereren.

Protocol

1. Het bepalen van optimale Verwarming Voorwaarden

Ten eerste moet men experimenteel de optimale incubatietemperatuur en tijd te gebruiken voor de verhittingsstap in de assay. Voor onze PlyC model, is het van belang op te merken dat E. coli gecotransformeerd met plyCA en plyCB genen op verschillende expressieplasmiden is aangetoond dat een volledig functionele PlyC holoënzym ^{6 te} vormen. De microtiterplaat met 96 putjes voorbereiding en celgroei omstandigheden en de daaropvolgende replica plateringstechniek zijn overgenomen van voorbeelden in de literatuur ^12-16. Een incubatietijd van 30 min zal zijn geschikt voor deze test zoals volgt uit eerdere experimenten thermische inactivatie bepalen snel verlies van activiteit gedurende korte incubatie in omgevingen dan fysiologische temperatuur (niet gepubliceerde waarneming). De optimale incubatietemperatuur voor PlyC werd toegelicht door de volgende stappen:

1. Transform de expressieconstruct pBAD24: plyCA (Amp ^r) in de bevoegde E. coli-stam DH5a pBAD33: plyCB (Cm ^r).
2. Plaat de transformanten op Luria-Bertani (LB) agar plaat aangevuld met ampicilline (100 ug / ml) en chlooramfenicol (35 pg / ml). Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 ° C.
3. Met een steriele tandenstoker, een individuele kolonie te enten in elke rij van putten (figuur 2a) in een steriele, heldere, platte bodem 96-well, met deksel microtiterplaat die 200 ul van LB aangevuld met ampicilline en chlooramfenicol bevat.
4. Veilig plaats de microtiterplaat met 96 putjes op een 37 ° C incubator schudden en gedurende de nacht bij 300 rpm bacteriën groeien.
5. Haal de microtiterplaat met 96 putjes van 37 ° C schudincubator en replica plaat om een ​​nieuwe microtiterplaat met 96 putjes als volgt:
   1. Voeg 180 ul van LB aangevuld met ampicilline en chlooramfenicolaan elk putje van de plaat replica.
   2. Breng 20 pl van bacteriën van de oorspronkelijke plaat de overeenkomstige putjes in de plaat replica. Dit moet resulteren in een initiële _OD600 van ~ 0,5.
6. Veilig plaats de replica plaat op de 37 ° C schudincubator en incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 300 rpm, en voeg dan de inductant. Bij de pBAD expressiesystemen, de inductant 0,25% arabinose. Andere expressiesystemen kunnen vereisen verschillende inductants. Plaats de plaat op de 37 ° C schudincubator en schudden bij 300 rpm gedurende nog eens 4 uur om voor eiwitexpressie. Expressie niveaus variëren meestal tussen 10-20 ug van PlyC.
7. Zodra eiwitexpressie heeft gesloten, halen de replica plaat en de bacteriën pellet door het plaatsen van de microtiterplaat met 96 putjes in een gekoelde centrifuge een swinging-bucket rotor die microtiterplaten met 96 putjes past bevat. Centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
8. Verwijder het supernatant media door langzaam inverteren van de microtiterplaat en voorzichtig decanteren van de media.
9. Lyseren de cellen door toevoeging van 50 ul B-PER II Bacteriële eiwitextractie Reagent aan elk putje. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
10. Het volume in elk putje om 120 pl door toevoeging van 70 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2.
11. Pellet de onoplosbare celresten door het draaien van de plaat bij 3000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C in de gekoelde centrifuge.
12. Breng 110 pi van de oplosbare ruwe lysaat op de overeenkomstige putjes van een plaat met 96 putjes thermocycler.
13. Met behulp van 30 min als de vooraf bepaalde incubatietijd, bloot de oplosbare lysaten momenteel woonachtig in de 96 goed thermocycler plaat voor een breed gradiëntbakken doorsnede 15-20 ° C. Opmerking Het doel is om te bepalen bij welke temperatuur een bepaald enzym verliest> 95% katalytische activiteit.
14. Na incubatie incubeer de 96 wellthermocycler plaat bij 4 ° C gedurende 5 min en breng 100 ui van de oplosbare lysaten van de 96 well plaat thermocycler hun overeenkomstige put locatie in de laatste 96 well microtiterplaat.
15. Met een 12-kanaals multipipettor, 100 pl GAS stam D471 in elk putje. Note worden D471 cellen oorspronkelijk gelyofiliseerd uit overnacht kweken en geresuspendeerd met PBS pH 7,2 tot een _OD600 verkrijgen van ~ 2,0.
16. Zij plaatst de plaat met 96 putjes in de microplaat spectrofotometer en te controleren enzymkinetiek door meting van de OD ₆₀₀ elke 15 sec gedurende 20 minuten. De laagste temperatuur incubatie die overeenkomt met putjes die een verandering in optische dichtheid (ΔOD ≤ 0,1) miste wordt gedefinieerd als de niet-permissieve temperatuur.

Na een breed temperatuur scherm uitgevoerd om de niet-permissieve temperatuur identificeren, kan de bovenstaande stappen worden herhaald een nauw bereik van temperaturen (5 ° -10 ° C) te helderende exacte niet-permissieve temperatuur voor het enzym van belang. Opmerking kan de niet-permissieve temperatuur die in deze assay anders dan de smelttemperatuur toegelicht andere wijze kunnen verschillen in volume, concentratie, etc.

2. Het genereren van de Mutant Bibliotheek

De instelling van de mutant bibliotheek gescreend omvat willekeurig waarin mutaties door een foutgevoelige DNA polymerase met minimale nucleotide bias in de plyCA gen met de GeneMorph II Random Mutagenesis Kit als volgt:

1. Ontwerp nucleotide primers met vergelijkbare smelttemperaturen _(Tm) tussen 55 tot 72 ° C met restrictieplaatsen van keuze bij de 5'-en 3'-uiteinden van het gen plyCA.
2. Aangezien de gewenste mutatie snelheid is 2-3 nucleotiden per plyCA (1,4 kb) met de PCR reactie component concentraties alsmede de thermocycler omstandigheden aanbevolen door de fabrikant laag mutation frequencies (0-4,5 per kb).
3. Kloon het gemutageniseerde plyCA genen in de expressievector pBAD24.
4. Transformeer de constructen in een DH5a pBAD33: plyCB achtergrond en transformanten plaat op LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline en chlooramfenicol.
5. Bovendien transformeren en plaat DH5a pBAD33: plyCB met de expressievector pBAD24 met de WT plyCA gen. Kolonies van deze plaat zal als controles tijdens screening.

3. Microtiterplaat met 96 putjes en Cell Preparation Groeiomstandigheden

1. Vul elk putje van een microtiterplaat met 96 putjes met 200 pl LB aangevuld met ampicilline en chlooramfenicol.
2. Na de microtiterplaat schema (figuur 2b), zorgvuldig te kiezen individuele kolonie van de nacht agar platen met een tandenstoker gesteriliseerd en beënt de bacteriën in de put van de aangewezen 96 well microtiter plate. Het is van wezenlijk belang slechts een kolonie per putje geïnoculeerd.
3. Schud de bodem verankerd microtiterplaat met 96 putjes bij 300 rpm bij 37 ° C.

4. Replica Plating, Protein Expression Inductie en Lysate Voorbereiding

1. Volg de stappen 1,5-1,11 uit de sectie getiteld "Het bepalen van de optimale verwarming voorwaarden" met een wijziging. Bewaar de oorspronkelijke plaat bij 4 ° C na de replica plating stap gesloten.
2. Na stap 1,11, overdracht 110 ul van de oplosbare ruwe lysaat op de overeenkomstige putjes van een plaat met 96 putjes thermocycler behalve de positieve controles A1-D1. Wat de positieve controle lysaten (dwz lysaten die niet verwarmd), overdracht 100 ul van de lysaten de overeenkomstige putjes in een nieuwe microtiterplaat met 96 putjes die zal dienen als de uiteindelijke assay plaat voor het experiment en op te slaan op ijs.

5. Oplosbare Lysaat Warmtebehandeling

1. Verwarm de negatieve controle en mutant oplosbare lysaten thans beperkt in de 96 well plaat thermocycler in de thermocycler gedurende 30 minuten bij geoptimaliseerde niet-permissieve incubatietemperatuur bepaald in stap 1.
2. Na niet-permissieve temperatuur incubatie incubeer de 96 well plaat thermocycler bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
3. Breng 100 pi van de oplosbare lysaten van de 96 well plaat thermocycler hun identieke putlocaties in de laatste 96 putjes microtiter testplaat reeds de positieve controle oplosbare lysaten.
4. Met een 12-kanaals multipipettor, 100 pl GAS stam D471 in elk putje. Onmiddellijk Plaats de plaat in de microplaat spectrofotometer.
5. Controleer de enzymkinetiek door meting van de OD ₆₀₀ elke 15 sec gedurende 20 minuten.
   1. Een PlyC variant met gevorderd thermisch gedrag wordt gedefinieerd als een construct dat de oorspronkelijke optische dichtheid met 50 procent daalt in minder dan 900 sec bij hetniet-permissieve temperatuur. Daarnaast is de positieve controle (niet verwarmd, WT PlyC) moeten WT katalytische activiteit vertonen (t _1/2 ≤ 100 sec) en de negatieve controles (bijvoorbeeld verwarmd, WT PlyC) moet geen activiteit.
6. Zodra een PlyC variant met gevorderd thermisch gedrag is geïdentificeerd, halen de oorspronkelijke plaat opgeslagen bij 4 ° C en beënt bacteriën van het individu en specifiek voor de mutante plaats in vers LB medium aangevuld met ampicilline en chlooramfenicol. Overnacht groeien het inoculum bij 37 ° C.
7. Extraheren en zuiveren plasmide DNA uit de kweek en dienen voor sequentiebepaling om de nucleotide mutaties die verbeterde thermische gedrag afleiden naar PlyCA identificeren. Bovendien vullen een kleine hoeveelheid van de nachtkweek met 10% glycerol en bij -80 ° C voor verder gebruik.

Results

Aan het einde van de eerste ronde van willekeurige mutagenese, werden meer dan 6.000 PlyC mutanten gescreend en in totaal 35 mutanten met potentieel verhoogde thermische gedrag werden geïdentificeerd, geselecteerd en gesequenced. Genomische analyse samengevat in tabel I blijkt dat van de 35 kandidaten 7 van de constructen bevatte WT PlyCA sequenties op het niveau van translatie, corresponderend met valse positieven die door de assay. Van de overige 28 kandidaten de mutatie bereik was 1 tot 6 nucleotide mutaties met een gemiddelde van 2,75 mutatiesnelheid nucleotiden per plyCA gen, dat in de 2-3 nucleotide mutatie range we richten. Op translationeel niveau, dit specifieke nucleotide mutatie en de frequentie leverde een aminozuur mutatie van 1 tot 5 aminozuren, met een gemiddelde van 1,9 mutaties aminozuurmutaties per PlyCA polypeptide.

Van de 28 kandidaten met ten minste een aminozuur Mutation, werden vier van deze mutant constructen willekeurig gekozen voor verdere karakterisering te valideren dat de uitgebreide screening proces van de gerichte evolutie methodologie inderdaad naar behoren functioneert. De mutant PlyC enzymen werden gezuiverd tot> 95% homogeniteit gebaseerd op SDS-PAGE-analyse zoals eerder beschreven ^6-7. Enzymkinetiek van WT PlyC en elk van de vier PlyC mutanten gekarakteriseerd in gelijke molaire concentraties na incuberen van de gezuiverde enzymen bij verschillende verhoogde temperaturen. Activiteit werd gecontroleerd na toevoeging van D471 GAS door de optische dichtheid bij 600 nm elke 15 sec gedurende 20 minuten. Activiteit werd gedefinieerd als de resterende maximum snelheid van het enzym na incubatie warmte. Van de vier kandidaten willekeurig geselecteerd voor verdere karakterisering, 29C3 mutant toonde de verbeterde thermische gedrag. Het thermische gedrag van WT PlyC en 29C3 onderzocht bij verschillende temperaturen gedurende incubatie en het testen op activiteit in PBS pH 7,2 bij80 nM en 40 nM concentraties respectievelijk. De 45-50 ° C incubatie experimenten (Figuur 3) werden uitgevoerd in een thermocycler de monsters werden in een dunwandige 96 well plaat thermocycler in een totaal volume van 120 ul. De 35 ° C, 40 ° C en 45 ° C incubatie experimenten (figuur 4 en 5) werden in een warmteblok de monsters werden in een 1,5 ml microcentrifugebuis geïncubeerd in een totaal volume van 1,3 ml. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud.

WT PlyC en 29C3 toonde geen significant verschil in kinetische stabiliteit bij kamertemperatuur (25 ° C) zoals weergegeven in de eerste set staven in figuur 3. Echter, na een korte incubatie gedurende 30 min bij temperaturen van 45-50 ° C, de activiteit van 29C3 aanzienlijk groter dan de activiteit specifiek voor de WT bouwen bij elke temperatuur punt. Bijvoorbeeld WT PlyC toonde een 44% verlies van activiteit bij 45,2° C terwijl 29C3 vertoonden slechts 2% verlies van activiteit bij dezelfde temperatuur.

Langdurige incubatie studies waarin de residuele activiteit van zowel WT PlyC en 29C3 werd daarbij uitgevoerd bij 35 ° C en 40 ° C waarbij de meting van restactiviteit na 24 en 48 uur tijdstippen. Bij 35 ° C, 29C3 weergegeven 41% en 176% hogere activiteit dan WT PlyC 24 en 48 uur incubatie tijdstippen respectievelijk (Figuur 4a). Bij 40 ° C, 29C3 weergegeven 28% en 107% hogere activiteit dan WT PlyC 24 en 48 uur incubatie tijdstippen respectievelijk (figuur 4b).

De restactiviteit van WT PlyC en 29C3 werden ook elke 20 minuten voor een totaal van 3 uur bij 45 ° C. WT PlyC kon slechts 21% activiteit behouden na 3 uur incuberen bij deze temperatuur terwijl 29C3 kon 46% activiteit behouden. De halfwaardetijd (t _1/2) voor WT PlyC en 29C3 respectievelijk 67 en 147 min respectievelijk suggereren ing dat 29C3 heeft een 2,2-voudige toename in kinetische stabiliteit bij 45 ° C (Figuur 5).

Totaal Ronde 1 Kandidaten	35
Kandidaten met WT PlyCA Sequence	7
Kandidaten met ≥ 1 aminozuur mutatie	28
- Gemiddelde Nucleotide Mutation Rate (nt / plyCA)	2,75
- Nucleotide Mutatie Range (nt)	1 tot 6
- Gemiddeld aminozuur mutatie Rate (AA / PlyCA)	1,9
- Aminozuur mutatie Range (AA)	1 tot 5

Tabel 1. Kandidaat Pool Genomic Analysis.

pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. Gerichte evolutie assay methode. In directed evolution, men start met de lead enzym die WT PlyC voor de eerste ronde. Een bibliotheek van mutanten met willekeurige PlyC onpartijdige nucleotide mutaties van het gen wordt vervolgens plyCA geconstrueerd door een foutgevoelige DNA polymerase, gekloneerd in de expressievector pBAD24 en getransformeerd in de E. coli stam DH5a al bevatten pBAD33:. plyCB individuele transformanten geënt in hun specifieke putje van een microtiterplaat met 96 putjes. Via een uitgebreide screening worden afzonderlijke PlyC mutanten die katalytisch actief zijn na incubatie bij een niet toegestane temperatuur geclassificeerd als mutanten met verbeterde kinetische stabiliteit. Construct weergeven van het verst gevorderde thermische gedrag zal derhalve de inleidende enzym voor de volgende ronde van willekeurige mutagenese. Over het geheel genomen zijn er drie volledige ronden van random mutagenese gevolgd door DNA-shuffling wat resulteert in een bacteriolytische molecuul met geëvolueerd thermisch gedrag. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. 96 well microtiterplaat templates voor gerichte evolutie assay. Microtiterplaat schema tijdens het bepalen van de optimale verwarming omstandigheden (figuur 2a) bestaat uit inoculeren een ouderlijke WT PlyC kloon in elke rij van de microtiterplaat. De microtiterplaat schematische tijdens mutant screening (figuur 2b) bestaat uit inoculeren elk putje in kolom 1 met een unieke ouderlijke WT PlyC kloon en inoculeren in elk putje kolommen 2-12 met een uitgesproken PlyC mutant kloon. Wells A1-D1 worden aangewezen voor de positieve ouderlijk toezicht, die medensist van WT PlyC constructen niet blootgesteld aan niet-toelaatbare temperatuur incubatie. Wells E1-H1 worden aangewezen voor de negatieve ouderlijk toezicht, die bestaan ​​uit WT PlyC constructies die worden blootgesteld aan niet-toegestane temperatuur incubatie.

Figuur 3. Restactiviteit kinetische analyse waarbij WT PlyC en 29C3. Enzymen werden tot homogeniteit gezuiverd en gedurende 30 min in een thermocycler met gelijke molaire concentraties aan beide kamertemperatuur of bij een temperatuur gradiënt lopend van 45-50 ° C. Enzymatische activiteit correleert met de maximale snelheid weergegeven na incubatie bepaalde temperatuur. Met uitzondering van 25 ° C en 47,7 ° C, de variatie in activiteit tussen WT en 29C3 bij elke temperatuur gecorreleerd met een p-waarde <0,05. Alle data worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten.

Figuur 4. Restactiviteit kinetische analyse waarbij WT PlyC om 29C3 bij 35 ° C en 40 ° C. Gelijke molaire concentraties van gezuiverde WT PlyC en 29C3 werden geïncubeerd in een verwarmingsblok bij 35 ° C (figuur 4a) of 40 ° C (figuur 4b). De resterende enzymactiviteit werd gemeten bij 24 en 48 uur tijdstippen. De activiteit weergegeven door elk construct werd genormaliseerd tot de maximale snelheid weergegeven op tijdstip nul. De variatie in activiteit tussen WT en 29C3 bij elke temperatuur en tijdstip gecorreleerd met een p-waarde <0,05. Alle data worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten.

Figuur 5. Restactiviteit kinetische analyse vergelekenWT PlyC om 29C3 bij 45 ° C. Gelijke molaire concentraties van gezuiverde WT PlyC en 29C3 werden geïncubeerd in een verwarmingsblok bij 45 ° C en de resterende enzymactiviteit werd gemeten om de 20 min gedurende 3 uur. De activiteit weergegeven door elk construct werd genormaliseerd tot de maximale snelheid weergegeven op tijdstip nul. Met uitzondering van de gegevenspunten op 20 min, de variatie in activiteit tussen WT en 29C3 op elk tijdstip gecorreleerd met een p-waarde <0,05. Alle data worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten.

Discussion

Dit protocol in figuur 1, vormt een microtiterplaat met 96 putjes werkwijze die toelaat om gerichte evolutie gebruiken om de thermostabiliteit van elke bacteriolytische enzym verhogen. Door het gebruik van een foutgevoelige DNA polymerase, kan willekeurige mutaties die de totale kinetische stabiliteit van het vertaalde bacteriolytische molecuul van belang, die doorgaans door moleculaire reorganisaties bestaande uit toenemende elektrostatische verhogen introduceren disulfidebrug en hydrofobe interacties die verbeterde genereren moleculaire verpakking, verbeterde wijzigingen van oppervlakte lading netwerken of versterken van een hogere oligomerisatie staat ^17-18. Na de introductie van nucleotide mutaties werd een uitgebreide screening procedure vervolgens gebruikt om mutaties die thermisch nuttig identificeren. De vertegenwoordiger hier gepresenteerde resultaten zijn gebaseerd op een ronde van willekeurige mutagenese. In werkelijkheid, is gesuggereerd datten minste drie opeenvolgende ronden van willekeurige mutagenese, waarbij telkens de meest robuuste mutant enzym de leiding, gevolgd door DNA shuffling is geschikt voor dit soort gerichte evolutie thermisch gedrag studies ^2.

Het is belangrijk te begrijpen dat dit protocol identificeert mutaties die kinetische stabiliteit te vergroten, deze varianten niet noodzakelijk thermostabiliteit toegenomen. Een molecuul wordt beschouwd thermostabiele wanneer zij de mogelijkheid om de structuur behouden bij hoge temperatuur. Echter in gepresenteerde test worden de resterende activiteit van het mutante lysaten niet getest bij dezelfde temperatuur dat zij oorspronkelijk werden geïncubeerd bij tijdens de warmtebehandelingsstap en dus een kan selecteren op mutaties die hervouwing plaats verbeterde thermostabiliteit ¹⁹ bevorderen. Terwijl we extrapolatie thermisch gedrag als een indicatie van de thermische stabiliteit, thermische stabiliteit moeten ware empirisch worden gemeten Biophysical methoden zoals circulair dichroïsme (CD), differentiële scanning calorimetrie (DSC) en differentiële scanning fluorimetrie (DSF). Voorlopige gegevens van cd's en DSF experimenten suggereren dat een aantal kandidaten geïdentificeerd uit de gepresenteerde methodiek wel degelijk vooruitgang geboekt thermostabiliteit (gegevens niet getoond) weer te geven.

Hoewel de methode hier gepresenteerde specifieke uitvoering verhoogde thermische gedrag PlyC, kan deze zelfde methode bovendien worden gebruikt om thermische activiteit te verhogen andere bacteriolytische enzymen met enkele kleine aanpassingen aan variabelen zoals buffers, mutatiesnelheden, verwarmingsomstandigheden en expressiesystemen. Een kritische variabele bij dit assay betrekking op de nucleotide mutatie snelheid van de foutgevoelige DNA polymerase. We kozen ervoor om de foutgevoelige Mutazyme II DNA-polymerase in onze gerichte evolutie test te wijten aan experimenteel bewijs suggereert dit specifieke enzym geeft de minste hoeveelheid bias metbetrekking tot welke nucleotiden willekeurig opgenomen in het gen van belang in vergelijking met andere willekeurige mutagenese technieken zoals het gebruik van hydroxylamine, E. mutator coli stammen en andere foutgevoelige DNA polyermases ^20. In het algemeen lager mutatiesnelheden algemeen wenselijker om twee redenen. Eerste techniek thermostabiliteit van eiwitten bestaat meestal uit relatief weinig aminozuursubstituties. Hoge mutatie tarieven kan leiden tot dramatische structurele veranderingen aan specifieke moleculen die onomstotelijk kan leiden tot structurele en functionele verschillen verkeerde vouwing. Zo kan de opname van glycine en proline residuen verstoren alpha helix secundaire structuren ^21. Tweede hoge nucleotide mutatie verhogen de kans op voortijdige waarin stopcodons, waardoor afgeknotte moleculen die biologisch inactief zijn. In het algemeen worden lagere mutatiesnelheden voorkeur omdat lagere fouten resulteren in accumulatie van adaptieve mutaties terwijl hogere mutatie tarieven genereren neutrale of schadelijke mutaties ^22.

Voor elke ronde van willekeurige mutagenese, een kritieke variabele dat men optimaliseren omvat de incubatietemperatuur tijdens de screening. Selectie van de experimentele niet-permissieve temperatuur relatief moeilijk. Wilden we eerst een incubatietemperatuur dat was 10 ° C hoger dan de niet-permissieve temperatuur van PlyC echter na screening 3000 mutanten We konden geen voordelige mutaties identificeren. Rekening houdend gerichte evolutie methoden uit elkaar identificeren uiteindelijk aminozuursubstituties die additieve effecten, werd vastgesteld dat een minder strenge temperatuur kan worden gewerkt tijdens de screening ook al verhoogde de kans op het genereren valse meldingen. Daarom gebruikten we een incubatietemperatuur dat slechts een paar graden boven de niet-Toegestive temperatuur en opnieuw gescreend geselecteerde kandidaten uit te sluiten van de vals-positieven.

We besloten een incubatietemperatuur die niet te gebruiken gematigde (≤ 1 ° C hoger dan de laagste niet-permissieve temperatuur) en omgekeerd niet te hard (≥ 5 ° C hoger dan de laagste niet-permissieve temperatuur). De ideale temperatuur besloten we gebruiken in dit assay was een gematigde 2 ° C lager dan de experimenteel bepaalde niet-permissieve temperatuur. Het kiezen van een temperatuur die te mild zal resulteren in een veel hogere vals positieve identificatie rate dan ~ 20% we waargenomen (Tabel I) bij gebruik van een matige incubatietemperatuur. Bovendien zou het gebruik van een incubatietemperatuur die te hard uiteindelijk resulteren in het onvermogen om mutanten te identificeren met aanzienlijk verbeterd thermisch gedrag. Bijvoorbeeld met een incubatietemperatuur van ≥ 5 ° C zou hebben geleid tot het onvermogen om de identiteitveelbelovend 29C3 mutant evenals de meeste andere kandidaten geselecteerd tijdens de eerste ronde van screening.

In som, bieden wij een protocol voor engineering bacteriolytische enzymen tot een verhoogde kinetische stabiliteit te verwerven. Bovendien kan deze zelfde assay zonder verwarming stappen worden gebruikt voor het screenen mutaties die katalytische activiteit te verhogen. Het verhogen van zowel de katalytische activiteit en thermostabiliteit is een belangrijke ontwikkeling hindernis geconfronteerd met een therapeutische enzym. Hoewel de details van dit protocol zijn specifiek voor het endolysine PlyC kan de methodologie worden aangepast aan elke bacteriolytische enzym met enkele aanpassingen. We voorlopige resultaten gepresenteerd van alleen de eerste ronde van mutagenese dat functionaliteit van de test valideert, resulterend in de implementatie en identificatie van mutaties die een toename in moleculaire thermostabiliteit van significante grootte te genereren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer
B-PER II Bacteriële Eiwit Extractie Reagens	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II willekeurige mutagenese Kit	Agilent Technologies	200500
Clear 96 Nou, platte bodem microtiterplaat met Deksel	BD Vacutainer Labware Medical	353072
96 Nou Nonskirted PCR-platen	Fisher Scientific	14-230-232
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-2-DWP
Ampicilline Natriumzout	Fisher Scientific	BP1760
Chlooramfenicol	Fisher Scientific	BP904
Arabinose	Fisher Scientific	BP2504
pBAD24 Expression Vector	ATCC	87399
pBAD33 Expression Vector	ATCC	87402