Een eenvoudige protocol voor het bereiden van extracten van menselijke weefsels worden gebruikt als bron van antigenen in functionele T-cel-assays beschreven. Deze methode laat T-cel responsen op weefsel afgeleide antigenen te meten In vitro.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extractie van Tissue Antigens voor functionele testen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel antigen doelstellingen van adaptieve immuunrespons, die door B en T cellen, niet gedefinieerd 1. Dit geldt met name voor auto-immuunziekten en kanker 2. Ons doel is het onderzoeken van de antigenen herkend door menselijke T-cellen in de autoimmuunziekte type 1 diabetes 1,3,4,5. De menselijke T-cel responsen te analyseren tegen weefsel waar de antigenen herkend door T cellen worden geïdentificeerd we een methode ontwikkeld om eiwitantigenen onttrekken menselijk weefsel in een formaat dat compatibel is met functionele assays 6. Voorheen T-cel responsen op ongezuiverde weefselextracten kon niet gemeten worden omdat de extractiemethoden opleveren lysaat vervat detergentia die toxisch voor menselijke perifere mononucleaire bloedcellen. Hier beschrijven we een protocol voor het extraheren van eiwitten uit menselijk weefsel in een formaat dat niet toxisch is voor humane T-cellen. Het weefsel wordt gehomogeniseerd in een mengsel van butaan-1-ol, acetonitril en water (BAW). De eiwitconcentratie in het weefsel extract wordt gemeten en een bekende massa eiwit verdeeld in buizen. Na extractie wordt de organische oplosmiddelen verwijderd door lyofilisatie. Gevriesdroogd weefselextracten kan worden opgeslagen tot zij nodig zijn. Voor gebruik in assays van de immuunfunctie, een suspensie van immuuncellen, in geschikte kweekmedia, direct kan worden toegevoegd om het gevriesdroogde extract. Cytokineproductie en proliferatie van PBMC als reactie op extracten bereid met deze methode, werden gemakkelijk gemeten. Vandaar onze werkwijze maakt de snelle bereiding van menselijk weefsel lysaten die kunnen worden gebruikt als bron van antigenen in de analyse van T-cel responsen. We suggereren dat deze methode de analyse van adaptieve immuunrespons vergemakkelijken weefsel bij transplantatie, kanker en auto-immuniteit.
Protocol
1. Voorbereiden miltweefsel
- Opmerking-alle menselijke materiaal moet worden behandeld als mogelijk infectieus en alle procedures moeten worden uitgevoerd in een klasse II Laminar Flow kabinet. Met steriele schaar en forceps, verwijder vet en bindweefsel van miltsecties (~ 1-2 cm in grootte) en afsnijden zoveel van de buitenste capsule mogelijk materiaal.
- Snij een klein stukje (1-2 cm 3) van de milt weefsel en plaats elk stuk in een steriele 50 ml Falcon buis.
- De stukjes weefsel snap invriezen door onderdompeling in vloeibare N2.
- Bewaren bij -80 ° C. Een soortgelijk protocol geschikt voor andere weefsel (s....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is ontwikkeld, omdat we wilden een uittreksel uit menselijk weefsel dat was vrij van giftige chemicaliën zoals wasmiddelen te genereren. Specifiek hebben we gebruikt om extracten van humane weefsels die kunnen worden gebruikt in assays van menselijke immuunsysteem in vitro bereiden. Extracten bereid met dit protocol kan ook worden opgelost in een buffer en voor vele biochemische analyses, zoals Western blotting of vloeistofchromatografie. Dit maakt deze techniek voor vele verdere toepassingen.
.......Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) en de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) en de operationele infrastructuur Regeling van de Victoriaanse regering. Wij danken de leden van de Tom Mandel Islet Transplantation Programma Islet Isolatie Team voor het verstrekken van de menselijke weefsels. Menselijke weefsels werden verzameld en gebruikt met de lokale ethische goedkeuring (St. Vincent's Hospital HREC-A 011/04 en St. Vincent's Health HREC-A 135/08).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| 5 ml 12 x 75 mm polystyreen buizen steriele | BD Falcon | 352054 | |
| Caps voor buizen polystyreenbuizen (boven) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml steriele buizen | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitril | Mallinckradt Chemicals | 2,856-10 | |
| Butaan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenisator: PRO200 | Bio-strategie | 01-01200 | 10 x 115 mm zaagtandgenerator |
| Vriesdroger | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Steriele naald 18 tot 20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Tabel 1. Specifieke reagentia en apparatuur.
Referenties
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identificat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
