Niet-invasieve beeldvorming van acute transplantaatafstoting na Rat niertransplantatie gebruiken<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Niet-invasieve beeldvorming van acute transplantaatafstoting na Rat niertransplantatie gebruiken

16.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4240

⸱

28 april 2013

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren hier een rat niertransplantatie model om niet-invasief te beoordelen acute transplantaatafstoting met behulp van positron emissie tomografie met 18F-fluorodeoxyglucose.

Samenvatting

Het aantal patiënten met eindstadium nierziekte, en het aantal nier transplantaat ontvangers continu toeneemt. Episodes van acute cellulaire transplantaatafstoting (AR) is een negatieve prognostische factor voor de lange termijn transplantaat overleving, en de tijdige diagnose is van cruciaal belang voor het transplantaat functie ^1. Momenteel AR alleen worden definitief gediagnosticeerd door kern-naaldbiopsie, die als een invasieve methode, ontbloot significant graft letsel of zelfs verlies. Bovendien biopsieën niet haalbaar zijn bij patiënten die anticoagulantia en de beperkte bemonstering plaats van deze techniek kan leiden tot vals negatieve resultaten als de AR is focale of fragmentarisch. Bijgevolg leidde dit tot een voortdurende zoektocht naar nieuwe AR detectiemethoden, die vaak worden gedaan bij dieren waaronder het gebruik van verschillende transplantatiemodellen.

Sinds de vroege jaren '60 rat niertransplantatie is een gevestigde experimentele methode voor de examinatie en analyse van AR ^2. We hierin aanwezig, naast kleine dieren positron emissie tomografie (PET) met ¹⁸ F-fluorodeoxyglucose (FDG) om AR te beoordelen in een allogene uninephrectomized rat niertransplantatie model en stellen graft FDG-PET als een nieuwe optie voor een niet-invasieve, specifieke en vroege diagnose van AR ook de menselijke situatie ^3. Verder kan deze methode worden toegepast voor de follow-up om de monitoring van afstoting ⁴ te verbeteren.

Protocol

1. Donor Organ Recovery

Stel de stereotactische microscoop, staat het gewicht van de 8-10 weken oude ratten (donor en ontvanger lichaamsgewicht moeten overeenkomen).
Verdoven van de donor rat (Lewis Brown Norway F1, LBN F1) gebruik van zuurstof / isofluraan inhalatie (isofluraan 4% / 2 L / min zuurstof). Onderhouden anesthesie door het verlagen van isofluraan tot 2-2,5%.
Plaats de verdoofde rat op de operatie pad. Bevestig extremiteiten van de rat met plakband op het pad en passen oogzalf (Bepanthen, Bayer) voor de ogen van de rat.
Scheren en ontsmetten de buik van de rat en het uitvoeren van een ventrale middellijn incisie vanaf het schaambeen tot de caudale rand van de lever. Expose de linker nier en de schepen door de darm voorzichtig te verplaatsen naar de rechterkant. Plaats een dunne plaat van gaas over de linker nier en bevochtigen met verwarmde isotone zoutoplossing om uitdroging te voorkomen.
Ontleden het vetweefsel zorgvuldig met Dumont Schuine Tip pincet (Dumont SS-45 tang Inox Medical, Fine Science Tools, cat.nr. 11203-25) omhult de linker ureter. Vermijd elk direct contact met de urineleider, in plaats daarvan, te mobiliseren het met voldoende omringende vetweefsel.
Scheid de linker nier-ader van de nierslagader behulp Dumont Schuine Tip pincet. Verwijder al het vet en bindweefsel van beide schepen en cauterize de bijnier en testiculaire vaten.
Ontleden aorta en inferior vena cava (IVC) boven en onder de kruising met de linker renale slagader en ader, respectievelijk, en cauterize alle uitgaande aderen.
Klem de suprarenale aorta met een microchirurgische klem (Micro Serrefines, Fine Science Tools, cat.nr. 18055-04) boven de linker nierslagader, zo dicht mogelijk bij de a. mesenterica superior. Afbinden van de infrarenale aorta met chirurgische zijde (5-0, Vömel, art.nr.. 14739) ca. 5 mm onder de linker nierslagader.
Afbinden de infrarenaal IVC met chirurgische zijde (5-0, Vömel), en klem de suprarenal IVCmet een microchirurgische klem (Micro Serrefines, Fine Science Tools, cat.nr. 18055-03).
Snijd de renale ader zo dicht mogelijk bij de IVC met behulp van fijne schaar (Iris Scissors - ToughCut Rechte 11,5 cm, Fine Science Tools, cat.nr. 14058-11).
Langzaam perfuseren de nieren in situ met 2 ml ijskoude HTK perfusie-oplossing (CUSTODIOL HTK, dr. Franz Köhler Chemie) door het invoegen van een canule (Microlance 3 27G ¾, BD, cat.nr. 302200) in de infrarenale aorta. Bevestigen dat de renale kleurveranderingen (nu olijf-getinte).
Ten eerste, doorsnijden de suprarenale aorta, dan de infrarenale aorta en tenslotte de ureter zo dicht mogelijk bij de urineblaas.
Verwijder de nieren en de vasculaire levering samen met de urineleider en winkel in HTK perfusie-oplossing op ijs.
Euthanaseren de donor rat door het verwijderen van de vasculaire klemmen en opeenvolgende excisie van het hart onder narcose.

2. Ontvanger Voorbereiding en transplantatietie

Stel de stereotactische microscoop, staat het gewicht van de rat.
Verdoven van de ontvanger rat (Lewis) met behulp van isofluraan 4%. Onderhouden anesthesie door het verlagen van isofluraan tot 2-2,5%.
Plaats de verdoofde rat op de operatie pad. Bevestig extremiteiten van de rat met plakband op het pad en toepassing oogzalf om de rat `s ogen. Bewaking en controle van de lichaamstemperatuur met behulp van een rectale temperatuur sensor en een warming pad. Tijdens de operatie herhaaldelijk controleren temperatuur, ademhaling en hartslag van het dier.
Scheren en ontsmetten van de buik en het uitvoeren van een ventrale middellijn incisie vanaf het schaambeen tot de caudale rand van de lever. Met een scalpel forcutting de huid om de huid trauma te minimaliseren. Expose de linker nier en de schepen aan door de darm aan de rechterkant.
Verwijder voorzichtig de nier capsule met behulp van Dumont Schuine Tip pincet en wattenstaafjes.
Occlude de linker nierslagader, ader en urineleider in de buurt van de renalehilum met twee ligations behulp van chirurgische draad (Mersilene 4-0, Ethicon, cat. nee. EH6732H). Accijns het grootste deel van de nier, waardoor alleen de renale navel. Reinig het snijvlak met wattenstaafjes en controleer op bloedingen. Voeg nog een ligatuur indien nodig.
Zorgvuldig ontleden botweg door het bindweefsel die de infrarenale aorta en vena cava op de staartvin site met wattenstaafjes.
Scheid zichtbare zenuwen van de infrarenale aorta en vena cava met Dumont Schuine Tip pincet.
Zorgvuldig ontleden door het bindweefsel vel tussen de infrarenale aorta en vena cava, die twee openingen van 2-4 mm lengte: De eerste onder de vertakking van de testiculaire vaten, en de tweede boven de vertakking van de iliaca vaten. Cauterize de iliolumbar slagaders en aders in tussen.
Teken een enkele chirurgische draad (Mersilene 0;. Ethicon, kat no.EH6665E) door elk van de twee openingen. Met behulp van deze draden trekt de infrarenaleaorta en vena cava zachtjes aan de rechterzijde van het dier toegang tot de vaartuigen vertakking op de dorsale terrein winnen. Cauterize een van deze schepen tussen de twee openingen en verwijder de chirurgische draden daarna.
Vervolgens aorta af te sluiten en IVC rechtsom toepassing van vier microchirurgische klemmen (Micro Serrefines, Fine Science Tools, cat.nr. 18.055-04) beginnend bij de bovenste opening van de aorta en eindigend met de vena cava in de bovenste opening (Micro Serrefines , Fine Science Tools, cat.nr. 18055-03).
Daarna voorzichtig doorboren het bovenste einde van het geïsoleerde deel van de aorta met een naald (Microlance 3 27G ¾, BD, cat.nr. 302200), steek de onderste blad van een mooie voorjaarsdag schaar (Vannas Lente Scissors - 3 mm Bladen, Fijn Science Tools, cat.no 15000-00) door de punctie opening en het uitvoeren van een korte longitudinale incisie. Spoel de geïsoleerde aorta met ijskoude HTK perfusie oplossing om alle resterende bloed te verwijderen.
Evenzo zorgvuldig prikkenhet onderste einde van het geïsoleerde deel van de vena cava met een naald, steek de onderste blad van een fijne lente schaar door de punctie opening en het uitvoeren van een longitudinale incisie eindigt kort onder de aorta incisie. Nogmaals, spoelen het schip om alle resterende bloed te verwijderen.
Verwijder het niertransplantaat uit de opslagoplossing. Plaats deze onder de oude functie van de linker nier, en ervoor zorgen dat deze correct is aangesloten.
Controleer de richting van de transplantaten nierslagader en ervoor zorgen dat er geen wendingen. Plaats dan een dun vel van gaas over de graft en bevochtigen met ijskoude HTK perfusie oplossing om het te koelen, en om uitdroging te voorkomen.
Fixeer de opening van het suprarenale gedeelte van de aorta werk waarin de renale slagader van het transplantaat opent in met chirurgische draad (Ethilon 9-0, Ethicon, catalogusnummer 2809G..) - Eerst aan de bovenste, dan aan het ondereinde van de aorta incisie. Sluit de incisie met de klok mee met een doorlopende hechting met chirurgische draad(Ethilon 9-0), Dumont Schuine Tip pincet en een gebogen Castroviejo naaldhouder (Fine Science Tools, cat. Nee. 12061-01). Daarna, hebben betrekking op de eerste hechting met bindweefsel via een linksom tweede continue hechtdraad. Nu alleen het onderste deel van de aorta-stuk van het implantaat nog gesloten. Regelmatig koelen de graft met ijskoude HTK perfusie-oplossing.
Perfuseren het transplantaat met 1 ml ijskoude HTK perfusievloeistof door een stompe naald ingebracht in het open einde van de aorta-enten stuk valideren van de dichtheid en de integriteit van de hechtdraad, alsmede het verwijderen van resterende bloed in het transplantaat. Daarna afbinden het open einde van de aorta stuk met chirurgische zijde (5-0, Vömel).
Controleer de richting van de transplantaten renale ader en ervoor zorgen dat er geen wendingen.
Fixeer de opening van de ader van het transplantaat met chirurgische draad (Ethilon 9-0) - eerst aan de bovenste, dan aan het ondereinde van de snede in de vena cava. Sluit de incisieklok met een doorlopende hechting met chirurgische draad (Ethilon 9-0), Dumont Schuine Tip pincet en een gebogen Castroviejo naaldhouder. Regelmatig koelen de graft met ijskoude HTK perfusie-oplossing.
Linksom verwijder de microchirurgische klemmen, te beginnen met de bovenste holle ader klem. Na het verwijderen van de laatste aorta klem, zorgvuldig stoppen uiteindelijk milde bloeden met wattenstaafjes. Na een paar seconden het transplantaat zal blijken rooskleurig-getint, en uretric contracties moeten verschijnen.
Voor het inbrengen van de implantaten urineleider naar de blaas van de ontvanger `s verwijder voorzichtig een klein stukje van de spieren aan de bovenkant van de blaas met behulp van een Vannas Lente Schaar (Student Vannas Lente Schaar recht, Fine Science Tools, cat.nr. 91500-09 ). Verwijder vervolgens het omliggende weefsel (vooral vet) uit het transplantaat urineleider behulp Dumont Schuine Tip pincet. Daarom voorzichtig pak de punt van de ureter en voorzichtig scheid de omringende vet bindweefsel en de ingebedde vaartuigen froben zij door deze te trekken in de tegenovergestelde richting. Fixeer de uretric tip aan het einde van een chirurgische draad (6-0 Prolene, Ethicon, cat.. 8697H) en perforeer de eerder bereide top van de blaas met de bevestigde naald. Trek de urineleider door de blaas en verlaat deze bij de basis door middel van een tweede perforatie.
Fixeer de eerder van de ureter afgescheiden weefsel bovenaan de blaas met chirurgische draad (Ethilon 9-0). Snij het puntje van de urineleider met de bijgevoegde chirurgische draad af en haal de urineleider terug in de blaas door zachtjes te duwen van onderaf. Daarna sluit de tweede blaas punctie met chirurgische draad (Ethilon 9-0).
Sluit de buikwand en de huid van twee continue maar aparte hechtingen met chirurgisch hechtdraad (Mersilene 0). Ontsmet de wond met behulp Pividon Jodium en beheren buprenorfine (0,1 mg per kg / BW / bod) sc gedurende drie dagen na de operatie om pijn wond te beheersen.

3. Imaging allograftafstoting

Verdoven nonfasting rat met isofluraan 2-2.5%.
30 MBq FDG (30 MBq FDG in 0,1 ml 0,9% NaCl) wordt intraveneus toegediend via catheterizing een laterale staartader met behulp van een 24 G katheter (Braun, Introcan, 4252500-01). Daarna spoelen de katheter met 0,9 ml 0,9% NaCl-oplossing.
Laat de rat in een restrainer zonder verdoving tot start van de scan en hydrateren de dierlijke iv injectie van 1 ml 0,9% NaCl-oplossing uur.
Re-verdoven rat met isofluraan 2% onmiddellijk voordat de scan begint.
Plaats verdoofde rat in een hoge-resolutie multi-wire kamerstelsel dier PET camera quadHIDAC (Oxford Positron Systems Ltd, Oxford, UK). De ruimtelijke resolutie van de PET-scanner is 1.0 mm en is constant over de gehele FOV (diameter, 165 mm; axiale lengte, 280 mm). Bewaking en controle van de lichaamstemperatuur tijdens de scan met behulp van een rectale temperatuur sensor en controle anesthesie met een pulse oxymeter.
Start dynamische acquisitie voor 60 mbij het starten van 180 min na FDG-injectie om tracer ophoping te verminderen in de nieren veroorzaakt door renale uitscheiding van FDG.
Breng 5 MBq ^18F-iv fluoride bevatten en voer PET scan onmiddellijk na ¹⁸ F-fluoride injectie gedurende 60 min zonder dat de positie van de rat in de scanner voor de identificatie van nierparenchym en voor het berekenen van ¹⁸ F-clearance ^5. Reconstrueren beelden van beide scans. Traceren handmatig een volume van belang (VOI) op gereconstrueerde beelden 2 min. na ¹⁸ F-fluoride injectie (perfusie-fase) rond renale cortex en breng de VOI om de FDG afbeeldingen. Exclusief het nierbekken van de VOI zorgvuldig. Reconstrueren beelden van beide scans en handmatig rond renale cortex een volume van belang (VOI) te traceren. List-modus gegevens werden gereconstrueerd in beelden met een voxel grootte van 0.4 × 0.4 × 0.4 mm ^3. Exclusief het nierbekken van de VOI zorgvuldig.
Berekenen FDG opname door de verhouding of totaal telt en volume en bereken het percentage geïnjecteerde dosis (% ID). We gebruikten MATLAB (Version R2011b, MathWorks, Natick, MA, USA) en tomografische beeldvorming (TIM) Versie 2.8 voor beeldanalyse.