In het diermodel beschreven in onze huidige werk gezuiverde IgG antilichamen tegen een stuk van 200 aminozuren (aa 757-967) van collageen VII herhaaldelijk geïnjecteerd in muizen reproduceren blaarvorming fenotype en de histo-en immunopathologische kenmerken vertonen de menselijke epidermolysis bullosa acquisita (EBA) 1.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Granulocyt-afhankelijke auto-antilichaam-geïnduceerde blaarvorming
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Auto-immune verschijnselen optreden bij gezonde personen, maar als zelf-tolerantie mislukt, de auto-immune reactie kan resulteren in specifieke pathologie. Volgens Witebsky postulaten, een van de criteria in de diagnose van auto-immuun ziekte als de reproductie van de ziekte bij proefdieren door passieve overdracht van autoantilichamen. Voor epidermolysis bullosa acquisita (EBA), een prototype orgaanspecifieke auto-immuunziekte van huid en slijmvliezen werden verschillende experimentele modellen onlangs. In het diermodel beschreven in onze huidige werk gezuiverde IgG antilichamen tegen een stuk van 200 aminozuren (aa 757-967) van collageen VII herhaaldelijk geïnjecteerd in muizen reproduceren blaarvorming fenotype en de histo-en immunopathologische kenmerken vertonen de menselijke EBA 1. Volwaardige wijdverspreide ziekte wordt meestal 5-6 dagen na de eerste injectie en de omvang van de ziekte correleert met de dosis van de toegediende collagen VII-specifieke IgG. De weefselbeschadiging (blaarvorming) in de experimentele EBA is afhankelijk van de rekrutering en activering van granulocyten door weefsel-gebonden antistoffen 2, -4. Daarom dit model het mogelijk om de ontleding van de granulocyt-afhankelijke inflammatoire pathway betrokken bij de auto weefselbeschadiging als model reproduceert alleen de T-cel-onafhankelijke efferente fase van de auto-immuunreactie. Verder wordt de waarde onderstreept door een aantal studies waaruit de blister-inducerende vermogen van autoantilichamen in vivo onderzoeken en het mechanisme van de blaarvorming in EBA 1,3, -6. Tenslotte zal dit model sterk de ontwikkeling van nieuwe anti-inflammatoire therapieën in autoantilichaam-geïnduceerde ziekten. Over het geheel genomen de passieve overdracht diermodel van EBA is een toegankelijke en leerzaam ziekte model en zal onderzoekers helpen om niet alleen EBA pathogenese te analyseren, maar om te antwoorden fundamenteel biologisch en klinischessentiële auto-immuniteit vragen.
Protocol
1. Voorbereiding van Pathogene Antilichaam
Opmerking: zuivering en concentratie van de antilichamen worden uitgevoerd op dezelfde dag als antilichamen niet worden opgeslagen in 0,1 M glycine pH van 2,5-3 (elutiebuffer) gedurende de nacht (ON).
Affiniteitszuivering van IgG: gebruik 25 ml immune konijnenserum:
- Ontdooi de konijnenserum ON bij 4 ° C, mengen 1:1 met 1xPBS (loopbuffer) en Centrifugeer bij 1260 g gedurende 10 min bij 20 ° C. Eventueel kan een filtratiestap met filtreerpapier worden opgenomen na centrifugeren bij het serum vet is.
- Ondertussen was de proteïne G matrix kolom gevuld met 10 bed volumes (bedvolume = matrix volume) van 1XPBS (lopende buffer).
- Breng de verdund en gefiltreerd serum aan de kolom en incubeer 1 uur op de schommelende platform bij kamertemperatuur (RT).
- Verzamel de doorstroom (FT) in een 50 ml tube Flacon. Gooi het tot de concentratieen titer van de gezuiverde IgG bekend.
- Was de matrix met 5 bedvolumes 1XPBS en in de tussentijd 50 ml Falcon buizen voor te bereiden voor het verzamelen van de geëlueerde IgG-fractie. Pipetteer 1 ml pH neutraliserende buffer: 1 M TRIS pH 10 in elke buis (anders de verhouding van 1:20 TRIS buffer opzichte van de hoeveelheid eluaat te verzamelen).
- Toepassing 100-150 ml elutiebuffer: 0,1 M glycine pH van 2,5-3 de kolom en verzamel 50 ml fractie (s). Draai de buis 2-3x, het meten van de pH-waarde en voeg neutraliserende buffergeheugen totdat u hebt bereikt de pH 7,2-7,4.
- Verzamel enkele druppels IgG eluaat en met de elutiebuffer als etalon de OD te meten bij 280 nm. Als de OD is <0,1 stop verzamelen.
- Regenereren proteïne G matrix en bewaar de instructies van de fabrikant.
Concentratie door ultrafiltratie met Amicon tubes:
- Was de Amicon Ultra (15 ml / 30 kDa) ultrafiltratie buizen met 1XPBS door centrifugeren 15-20 minbij 3.220 xg bij 4 ° C. Gooi de FT van de Amicon.
- Vul de Amicons met 15 ml geëlueerde IgG fractie en centrifugeer gedurende 25-30 min bij 3.220 xg en 4 ° C; centrifugeertijd altijd afhankelijk van het eiwitgehalte van het eluaat.
- Gooi FT en herhaal ultrafiltratie tot je hebt geen geëlueerde fractie verlaten.
- Was de geconcentreerde IgG uitgebreid, tweemaal, met 1XPBS 25-30 min. door centrifugeren.
- Verzamel de "sticky" gelige antilichaamoplossing uit de Amicon filter in een eindvolume van 1500-2000 ui 1XPBS.
- Meet de concentratie van IgG preparaat met behulp van een spectrofotometer of NanoDrop:
Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x verdunningsfactor / 1,4 - Wassen en opslaan Amicons de instructies van de fabrikant.
2. Injectie van collageen VII-specifieke IgG in Mice
Voor het eigenlijke experimentele procedure, zorg ervoor dat de experimentele proprotocol is geschreven en alle materialen worden voorbereid voor het experiment.
- Bereid de data sheets voor de ziekte scoren, ELISA, immunofluorescentie (IF) analyse en myeloperoxidase (MPO) test 4.
- Label de buizen voor bloed en organen, cryomolds en histologie verwerking en inbedding cassettes.
- Het antilichaam oplossingen worden bereid vers of ontdooid uit voorraden en gekarakteriseerd met betrekking tot hun reactiviteit (titer door IF microscopie en / of ELISA). De steriele gefilterde antilichaam oplossing worden verdund in PBS zodanig dat de vereiste dosis voor injectie varieert tussen 250-1000 ui. Zorg ervoor dat u voldoende IgG aan het hele experiment uit te voeren.
- Bereid anticoagulant: heparine 20 U / ml en 8,7 mg / ml ketamine / 1,3 mg / ml xylazine mengsel anesthesie. Wanneer het opofferen van de muizen buizen gelabeld met 3,7% formaldehyde bereid.
- Steriliseer chirurgische instrumenten (scalpel, schaar, fijne punt en Curved forcipes) en de voorbereiding van spuiten (insuline spuiten, 1 en 2 ml spuiten), naalden, digitale camera en extra geheugenkaart.
Let op: Voer alle procedures op ketamine / xylazine of isofluraan verdoofd muizen Isofluraan de voorkeur verdoving optie voor de dagelijkse verzorging controles, zoals muizen snel te herstellen.. Echter, bij het nemen van foto's, 87 mg / kg ketamine en 13 mg / kg xylazine gewoonlijk subcutaan geïnjecteerd. Voor euthanasie de ketamine / xylazine dosering verhoogd tot 130 mg / kg ketamine en 20 mg / kg xylazine.
- Controleer de reeds gemarkeerde dieren voor hun algemene gezondheidstoestand, de huid en de vacht voorkomen, wegen en meten hun oor dikte (altijd vasthouden aan hetzelfde oor).
- Registreer waargenomen waarden en veranderingen in de klinische evaluatie sheet.
- Verzamel 20-30 pl (2-3 druppels) bloed uit de staartader in een spuit met hetzelfde volume van antistollingsmiddel.
- Desinfecteer de vacht enhuid met 80% ethanol.
- Injecteer het antilichaam oplossing subcutaan in de rug met behulp van een insulinespuit. (Voor bepaalde plekken (zoals de oren) slechts kleine hoeveelheden (10-50 pi) die haalbaar zijn om te worden geïnjecteerd.)
Injecties moeten worden herhaald om de tweede dag, 4 keer. Balb / c en C57BL6 muizen van een lichaamsgewicht van ongeveer 20 g begint de ziekte ontwikkelen 3-4 dagen na de eerste toediening van 400-500 tot 750 ug / g lichaamsgewicht / injectie autoantilichamen.
Bij het afwerken van het experiment:
- Zet de muizen onder diepe narcose door injectie 130 mg / kg en 20 mg / kg ketamine / xylazine subcutaan, exsanguinate ze de posterior vena cava en knip het hart uit.
- Verzamel organen / weefsels monsters, zoals de huid: staart, oren, bloed en slokdarm en zet ze in eerder gelabeld en PBS of 3,7% formaldehyde gevulde buisjes.
Bij terugkeer naar delaboratorium:
- Centrifugeer het bloed op 1.200 xg, 10 min bij RT om afzonderlijke plasma, de overdracht van de plasma correct geëtiketteerd buizen en dienovereenkomstig te slaan.
- Embedden de huid biopsie in optimale cut Temperatuur medium met behulp van cryomolds, goed label en bewaar ze bij -80 ° C.
- Plaats de weefselmonsters bestemd voor histologie in het gelabelde inbedding mallen en bewaar ze op 3,7% formaldehyde tot paraffine inbedding.
3. Klinische evaluatie van ernst van de ziekte
Muizen moet dagelijks worden onderzocht op beschadigingen van huid en slijmvliezen en de bevindingen moeten worden geregistreerd met behulp van passende vormen. De criteria voor vroege euthanasie huidletsels bij meer dan 20% van het lichaamsoppervlak en een gewichtsverlies van 5-10% van het totale lichaamsgewicht in drie opeenvolgende dagen gerekend voor een ziekte score van 5 (tabel 1).
- Plaats de muis op zijn buik. Begin met het hoofd gebied, namelijk met de juisteoor en controleer blaren, erosie, korst aan de binnenzijde als aan de buitenzijde. Ga op dezelfde manier met het linker oor.
- Rechts en links de ogen worden gecontroleerd op tekenen van erytheem, alopecia, erosies en / of korst.
- Voorhoofd en snuit gebied worden geborsteld door volgende, verder te gaan met het ventrale deel van de snuit, lippen en het slijmvlies van de mond.
- Onderzoek de rechter voorpoot vanaf de poot, het verplaatsen naar boven, naar het linker voorpoot. Dezelfde procedure met de rechter en linker achterpoten.
- Borstel door de vacht op de hals en rug met een gebogen fijne punt tang.
- Draai de muis op de rug en controleer de ventrale deel en de ventrale kanten van de benen op dezelfde manier als eerder.
- Controleer de staart.
- Neem foto's van de relevante delen van het lichaam waar de muizen ontwikkelen ziekte. Er moet aandacht worden besteed aan de kwaliteit en kwantiteit van de foto's.
- Bereken de klinische ziekte scores.
4. Analyse van de Huid en plasmamonsters
- Bereid, opslaan en / of verwerken van alle verzamelde weefsels volgens het plan.
- Snijd bevroren weefsel secties voor IF detectie van konijn antilichamen en muis complement systeem componenten.
- Analyse van de verschillende eiwitten en enzymgehalte (MPO assay) van bevroren weefsel en / of orgaan extracten.
- Gedeelte paraffine ingebed weefsel en kleuren met H & E de mate van weefselbeschadiging te visualiseren.
- Analyseren plasma door ELISA, immunoblot.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De passieve overdracht van antigeen specifieke antilichamen resulteert in een full blown ziekte in muizen, die lijkt op de klinische, histologische en immunopathologische niveaus van de menselijke EBA. Blaren, korsten, erosies en alopecia ontwikkelen op de oren, snuit, poten, benen, rug en rond de ogen van de muizen. De eerste klinische tekenen van de ziekte zal waarschijnlijk op de oren en / of hoofdgebied. Depositie van specifieke konijn IgG, en de muis complement C3 wordt gedetecteerd door directe IF op de huid epide...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De passieve overdracht van antistoffen in proefdieren is een belangrijke benadering voor het demonstreren van hun pathogeniciteit 7, -12. Diermodellen verkregen door deze methode, naast het feit dat het indirect bewijs voor autoimmuniteit 13, zodat het onderzoek van de efferente fase van de pathogenese. De passieve transfer model van antilichaam-geïnduceerde granulocyt-afhankelijke blaarvorming van epidermolysis bullosa acquisita (EBA) werd gebruikt om de mechanismen van weefselschade in autoimmune...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen ondersteuning door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 en BIOSS van de Medische Faculteit van de universiteit van Freiburg (CS).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| recombinant antigen | De plasmiden coderen voor de recombinante vormen van murine collageen VII zijn bij de desbetreffende auteur. | ||
| immuun konijnenserum | www.eurogentec.com | We hadden New Zealand White konijnen geïmmuniseerd met 200 ug antigeen, 3 keer op 2 weken. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van de diensten van Eurogentec SA, België. | |
| Proteïne G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb / c muizen | Charles River Laboratories | ||
| Oktober verbinding, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | LGO, optimale snijtemperatuur |
| Cryomold standaard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Cryomold intermediaire | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09 tot 0503 | Histologie verwerking en inbedcassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund & Richard Herberholz GmbH & Co KG | 71492000 | tatoeëren pasta |
| Tatowierzange TZ1 | Ebeco E. Becker & Co GmbH | tatoeëren apparaat | |
| Heparine | Carl Roth GmbH & Co | 7692,1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH & Co | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazinehydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| steriele PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digitale camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Injectiespuit aangedreven filtereenheid 0,45 urn | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributeur) |
| ziekte scoreblad | Bijvoorbeeld kastsed |
Referenties
- Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
- Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
- Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
- Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
- Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
- Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
- Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
- Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
- Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066(2012).
- Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
- Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
- Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
- Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
- Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
- Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
- Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
- Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
