Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

Summary

We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.

Abstract

De studie van cel responsen op de omgeving vormt vele experimentele problemen: cellen moeten worden afgebeeld onder wisselende omstandigheden, vaak als vergelijkend onderzoek. Putjes en worden routinematig gebruikt om vele verschillende stammen of cellijnen vergelijken, maar laat beperkte controle over de omgeving dynamiek. Microfluïdische apparaten, anderzijds, kunnen uitstekende dynamische controle over de omgevingsomstandigheden, maar het is moeilijk om te onderscheiden afbeelding en meer dan een paar stammen in hen. Hier beschrijven we een methode om gemakkelijk en snel produceren een microfluïdische inrichting kan toepassen dynamisch veranderende omstandigheden meerdere verschillende giststammen in een kanaal. De inrichting is ontworpen en vervaardigd door eenvoudige middelen zonder zachte lithografie. Het bestaat uit een Y-vormige stromingskanaal aan een tweede laag herbergt microwells. De stammen in aparte microwells, en afgebeeld onder exact dezelfde dynamische omstandigheden. We demonstrate het gebruik van de inrichting voor het meten van eiwit lokalisatie reacties op impulsen van voedingsstoffen veranderingen in verschillende giststammen.

Introduction

Cellen worden voortdurend reageren op een dynamisch veranderende omgeving, door hun metabolisme transcriptionele profiel en celfuncties. Om deze fenomenen te bestuderen, zijn methoden die kunnen kwantificeren dergelijke veranderingen nodig zijn. Een soort uitlezing voor deze reacties is de verandering in de lokalisatie van stress gerelateerde transcriptiefactoren in reactie op voeding stress.

Microfluïdische inrichtingen ¹ zijn gebruikt om dynamisch omgevingsomstandigheden manipuleren om cellen ^2-4. Ze vertonen vele voordelen voor beeldvorming van levende cellen: de omgeving van de cellen nauwkeurig worden gecontroleerd en dynamisch veranderd; cellen live-belichte te allen tijde, ook tijdens manipulatie van externe omstandigheden en minimale reagensvolumes vereist. Een zeer eenvoudige ontwerp voor een microfluïdische apparaat, waardoor afwisseling twee voorwaarden is een Y-vormige inrichting ^2. We routinematig gebruik Y-vormige microfluïdische inrichtingen dietoepassing van dynamische veranderingen van de cellen in het kanaal. Wij gebruiken dit apparaat aan localisatie veranderingen van fluorescent gelabeld stress gerelateerde transcriptiefactoren in gistcellen te volgen. We volgen deze veranderingen onder veranderende nutritionele omstandigheden. Zo kunnen wij een puls (of pulstrein) van glucose-bevattend medium binnen no-glucose medium op een zeer fijne tijdsresolutie. Vaak in dergelijke experimenten is men geïnteresseerd in het vergelijken van de reacties van verschillende cellijnen (bijvoorbeeld verschillende mutanten, of verschillende wild isolaten). De Y-vormige goot is beperkt tot een stam in elk kanaal - indien meer dan een stam wordt gebruikt, is er geen eenvoudige manier om onderscheid te maken tussen de stammen. Om dit te ondervangen kunnen verschillende kanalen worden gebruikt. Als we willen dezelfde dynamiek voorwaarden gelden voor meerdere stammen, willen we de Y-kanalen in combinatie met meerdere kanalen. Er zijn twee uitdagingen in de uitvoering van deze oplossing: Het kan moeilijk zijn om t toe te passenhij dezelfde voorwaarden tegelijkertijd alle kanalen, en er is een geometrische beperking van het aantal Y-kanalen worden aangebracht in een apparaat. We waren dan ook op zoek naar een manier voor het bekijken van verschillende stammen in een kanaal onder dynamische omstandigheden.

Hier beschrijven we een tweelaags microfluïdische apparaat voor beeldvorming meerdere stammen in een kanaal onder dezelfde dynamische omstandigheden. De onderste laag bestaat uit dunne PDMS met een rij gaten. Deze laag is aangebracht op de glazen dekglaasje maken putten waarin plaatsen wij de verschillende stammen, hechten ze met Concanavaline A het glas. De tweede laag is een Y-vormige microfluïdische apparaat gemaakt met de plakband methode ^5. Nadat de stammen in de putjes de tweede laag snel uitgelijnd en bevestigd aan de eerste, waardoor een kanaal met meerdere putjes die de verschillende stammen bevatten. Deze laatste apparaat maakt na verscheidene stammen in een kanaal, waar allestammen aan dezelfde omstandigheden op hetzelfde moment. Het gehele ontwerp en productieproces kan de stationaire, met eenvoudige middelen, zonder zachte lithografie.

Protocol

1. Het creëren van een Scotch-tape Master ⁵

1. Teken of print de gewenste microkanaal lay-out, op schaal, op papier. In ons geval het ontwerp bestaat uit twee Y-vormige kanalen, elk 3 mm breed (figuur 2).
2. Bekleed een glazen schuif met lagen plakband. Het aantal lagen bepaalt de hoogte van het kanaal (ongeveer 60 pm per laag). We gebruikten 3 plakband lagen.
3. Plaats de lay-out ontwerp op een vlakke ondergrond. Lijn de schuif over het ontwerp patroon. Knip voorzichtig de tape op het glas dia met een scalpel volgens de lay-out.
4. Verwijder de Scotch tape van alle gebieden van het objectglaasje uitzondering in de layout van het microkanaal.
5. Plaats de dia in een verwarmingsoven bij 65 ° C gedurende 2-3 minuten. Reinig voorzichtig met ethanol.

2. Het vervaardigen van een PDMS microfluïdische apparaat

1. Meng de base en de katalysator componenten van PDMS zoals aanbevolen door de fabrikant. We maken gebruik van een 10:1verhouding base tot verharder. Giet ongeveer 30 ml van PDMS mengsel in een petrischaal op een hoogte van 0,5 cm ~. Ontgas de PDMS in vacuum indien nodig. Dompel het glas dia in de PDMS met de patroon Scotch tape naar boven. Het plaatsen van de patroon na de PDMS voorkomt de vorming van luchtbellen tussen de dia en schotel bodem. Uitharden gedurende 48 uur bij 65 ° C, zonder dat de horizontale schaal is met een waterpas.
2. In een nieuwe 90 mm petrischaal pour 3 ml van PDMS mix resulteert in een laag van ongeveer 0,5 mm diep. (Als een spin coater beschikbaar is, kan worden gebruikt voor deze fase).
3. Degas en genezen als in 2.1.
4. Voorzichtig uitgesneden de microfluïdische apparaat op de gewenste grootte met een scalpel. Deze laag wordt aangeduid als de "flow laag".
5. Knip een even groot stuk dunne laag PDMS van de tweede petrischaal. Dit wordt aangeduid als de "putten laag".
6. Gebruik een geschikte grootte biopsie puncher (We gebruiken 1,2 mm ID) om punch gaten voor de in-en uitgangen in de stroom laag.
7. Plaats de putjes laag op een dikke glasplaatje de ontwerpopmaak en punch uit putten, met 2 mm ID biopsie puncher, in lijn met de microkanalen op de baan.
8. Reinig zowel PDMS lagen en een 24 mm x 60 mm glas dekglaasje met ethanol. Air-droog en schoon te houden.
9. Plasma behandelen zowel het glas dekglaasje en de putten laag PDMS gebruik van standaard-plasma etser (voor niet-omkeerbare binding) of een hand-held corona treater ⁶ voor omkeerbare binding. Plaats de wells laag bovenop het dekglaasje om de hechting veroorzaakt (figuur 3). Voorzichtig wrijf eventuele luchtbellen weg (indien nodig).

3. Cell Imaging Experiment

1. Zorg ervoor dat u de gewenste media klaar in de juiste spuiten aangesloten op flexibele kunststof buizen met een inwendige diameter van 0,02 "(Tygon) in de injectiepomp.
2. Grow S. cerevisiae stammen met de gewenste fase in vloeibare YPD. Vortex grondig en plaats 300 μl van elke stam in een microcentrifugebuis.
3. Plaats voorzichtig 1 pl concanavaline A (Sigma) 2 mg / ml in elk putje. Spoel de overtollige Concanavaline A uit elk putje twee keer door voorzichtig pipetteren water.
4. Terwijl de Concanavaline A droogt, tweemaal wassen stammen met 300 pl SC medium zonder glucose. Wassen resterende glucose uit de celwanden helpt een goede naleving van de Concanavaline A.
5. Vortex cellen grondig. Pipetteer 0,75 ul of minder van elke celsuspensie in zijn eigen bron (figuur 3). Voorzichtig wassen van resterende cellen met rijk medium. De volgende twee stappen snel moeten worden uitgevoerd om cellen te voorkomen uitdroogt.
6. Plasma behandelen de chip en de putten grondig met de hand-held corona treater, zorg dat u direct druk op de putten. Plaats de chip op de putten, met veel aandacht voor de afstemming tussen de twee (deze stap kan worden gedaan onder een stereoscoop). Druk voorzichtig op de twee lagen van de PD houdenMS. Langzaam volledig vullen van het apparaat met ongeveer 50 ul rijk medium, zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven in het kanaal.
7. Sluit het apparaat, het plaatsen van de buizen in de juiste ingangen en start media stromen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingevoerd in het apparaat als deze kan lastig te verwijderen, dit kan worden bereikt door het loskoppelen van een inlaat of uitlaat en zachtjes te tikken op het apparaat waar de bubbels zijn, zorg dat u het glas dekglaasje breken.
8. Plaats onder microscoop en passende imaging punten in elk putje.
9. Houd de cellen onder rijk medium-stroom voor 1 uur of langer naar herstel toe indien nodig.
10. Het experiment: we constante stroom van beide spuitpompen om terugstroming van de media te voorkomen veranderende relatieve stroomsnelheden zoals gewenst. Een pomp instelling tot 0,8 ml / uur en pomp B tot 0,2 ml / uur resulteert in medium A stroomt dan 80% van de breedte van het kanaal (figuur 4). Dit kan dynamisch worden copgehangen door het veranderen van de twee stromen. De nieuwe voorwaarden stabiliseren in seconden over de gehele lengte van het kanaal ^2.

Results

Om de scheiding tussen de verschillende stammen demonstreren we twee onderscheidbare giststammen afgebeeld in alternatieve bronnen. Imaging volledige putjes vertoont geen lekkage tussen cell wells (Figuur 5a, b). Beide stammen hebben de transcriptiefactor MSN2 getagd met YFP. Om de gelijktijdige effect van dynamisch veranderende omstandigheden te testen, het debiet ingeschakeld in de twee ingangskanalen, waardoor een stap van no-glucose medium, die lokalisatie van MSN2-YFP geleid naar de kern (f...

Discussion

In dit artikel presenteren we een eenvoudige benchtop methode voor het maken van een microfluïdische apparaat dat volgende verschillende giststammen tegelijkertijd laat onder dynamische omstandigheden. Na verscheidene stammen in een kanaal biedt een betrouwbaar instrument voor het vergelijken van de dynamiek van enkele cel responsen in multiple stammen. Een voordeel van onze aanpak is de mogelijkheid om de inrichting te fabriceren met eenvoudige technieken zonder een clean room. In feite hebben we ook uitgevoerd het pro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens / Equipment	Vennootschap	Catalogusnummer
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning USA
Vacuümexsiccator	Nalgene	5310-0250
Biopsie punchers	Ted Pella Inc	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15.074 (1,2 mm)
Spuitenpompen	Chemyx	Fusion 200
Corona treater	Electro-techniek producten	BD-20
Tygon slangen	Tygon	S-54-HL
Concanavaline-A	Sigma	C7275
Plakband	3M Scotch	Transparante Tape 1/2 "