Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

Summary

We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling onderzocht In vivo Behulp van genetisch gemanipuleerde muizen op een wildtype of T-celreceptor transgene achtergrond.

Abstract

Een gezond immuunsysteem vereist dat T-cellen reageren op vreemde antigenen, terwijl de resterende tolerant voor zelf-antigenen. Willekeurige herschikking van de T cel receptor (TCR) α en β loci genereert een T cel repertoire met enorme diversiteit in antigeenspecificiteit, zowel zelf als buitenlandse. Selectie van het repertoire tijdens de ontwikkeling in de thymus is cruciaal voor het genereren veilige en nuttige T-cellen. Defecten in thymus selectie bijdragen tot de ontwikkeling van auto-en immunodeficiëntie aandoeningen ^1-4.

T cel voorlopers voer de thymus als dubbele negatieve (DN) thymocyten die geen expressie CD4 of CD8 coreceptoren. Expressie van het αβTCR en beide co-receptoren optreedt bij de dubbele positieve (DP) podium. Interactie van de αβTCR met zelf-peptide-MHC (pMHC) door thymus cellen bepaalt het lot van de DP thymocyten. Hoge affiniteit interacties leiden tot negatieve selectie en opheffingtie van zelfontledende thymocyten. Lage affiniteit interacties resulteren in positieve selectie en ontwikkeling van CD4 of CD8 enkele positieve (SP) T-cellen herkent vreemde antigenen gepresenteerd door zelf-MHC ^5.

Positieve selectie kan worden onderzocht in muizen met een polyklonaal (wildtype) TCR repertoire door het observeren van de generatie van rijpe T-cellen. Zij zijn echter niet geschikt voor de studie van negatieve selectie, die kleine deletie van antigeen-specifieke populaties omvat. Veel modelsystemen zijn gebruikt om negatieve selectie bestuderen maar in hun vermogen om vatten fysiologische gebeurtenissen ⁶ verschillen. Bijvoorbeeld, in vitro stimulatie van thymocyten mist de thymus omgeving die nauw betrokken is bij selectie, terwijl toediening van exogeen antigen kan leiden tot niet-specifieke deletie van thymocyten ^7-9. Op dit moment, de beste tools voor het bestuderen van in vivo negatieve selectie zijn muizen die een transg drukkenENIC TCR specifiek voor endogene zelf-antigeen. Echter, veel klassieke TCR transgene modellen gekenmerkt door premature expressie van het transgene TCRα ketting aan de DN, resulterend in premature negatieve selectie. Ons laboratorium ontwikkelde de HY ^cd4 model, waarbij de transgene HY TCRα voorwaardelijk wordt aan het DP stadium, waardoor negatieve selectie in de DP optreden SP overgang zoals bij wildtype muizen ^10.

Hier beschrijven we een flowcytometrie-based protocol thymus positieve en negatieve selectie onderzoeken de HY ^cd4 muismodel. Terwijl negatieve selectie in HY ^CD4 muizen zeer fysiologische Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere TCR transgene modellen. We brengen u ook algemene strategieën voor het analyseren van positieve selectie in een polyklonaal repertoire van toepassing op alle genetisch gemanipuleerde muizen.

Protocol

Zie Figuur 1 voor een algemene regeling van het experimentele protocol.

1. Ontleding

1. Plaats steriele stalen gaas scherm in 60 x 15 mm petrischaal. Een eenheid nodig per weefselmonster.
2. Voeg 5 ml gebalanceerde zoutoplossing Hank's (HBSS) bij elk gerecht. Houd gerechten op ijs.
3. Euthanaseren muizen met CO _2.
4. Secure muis om dissectie oppervlakte, ventrale zijde naar boven. Spray muis met 70% ethanol voor sterilisatie en dat de vacht is gematteerd beneden.
5. Met behulp van chirurgische schaar, beginnen dissectie door het maken van een ventrale incisie in de buik h....

Results

In fysiologische TCR transgene modellen en WT muizen, positieve selectie begint bij de DP ^heldere stadium vóór het verplaatsen in de DP ^saaie fase na antigen tegenkomen. DP ^dof thymocyten voer vervolgens een overgangsperiode CD4 ⁺ CD8 ^lo fase voordat hij CD4SP of CD8SP thymocyten (Figuur 2B). Rijpe thymocyten SP worden gekenmerkt door hoge TCR expressie en verlies van CD24 (Figuur 2C). Terwijl de CD8 door CD4 profiel kan defecten op.......

Discussion

De hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie in niet-transgene en TCR TCR transgene muizen onderzocht. Dit protocol beschrijft de kleuring van oppervlakte-antigenen. Voor verdere analyse van moleculaire mechanismen, is het vaak noodzakelijk om intracellulaire kleuring uitgevoerd. We maken gebruik van de BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit voor de meeste intracellulaire eiwitten en de BD Biosciences Foxp3 Staining Kit voor transcriptiefactoren. We meestal verkrijgen onze monste.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Gebalanceerde zout HyClone Hank's oplossing	Thermo Scientific	SH30030.02
Metalen gaas schermen	Cedarlane	CX-0080-E-01
Petrischalen (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Spuiten (3 ml)	BD Biosciences	309657
Conische buizen (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscoop	Zeiss - Primo Star	415500-00XX-000
Hemocytometer	HausserWetenschappelijk	3110
96-well plaat	Sarstedt	82.1582.001
Meerkanaalspipet	Fisherbrand	21-377-829
Foetaal kalfsserum	PAA	A15-701
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Fisher Scientific	SH3025802
Natriumazide	IT Baker Chemical Co	V015-05
FcR blokkerend reagens			Clone 2.4G2
Anti-muis HY TCR	eBioscience	XX-9930-JJ *	Clone T3.70
Anti-muis CD4	eBioscience	XX-0042-JJ *	Kloon RM4-5
Eennti-muis CD8a	eBioscience	XX-0081-JJ *	Clone 53-6,7
Anti-muis CD24	eBioscience	XX-0242-JJ *	Clone M1/69
Anti-muis TcR	eBioscience	XX-5961-JJ *	Clone H57-597
Anti-muis CD69 Gebiotinyleerd	eBioscience	13 tot 0691-JJ *	Clone H1.2F3
Anti-muis CD5 Gebiotinyleerd	eBioscience	13-0051-JJ *	Clone 53-7,3
Streptavidine	eBioscience	XX-4217-JJ *
Flowcytometer	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS buisjes	BD Biosciences	352052
Flowcytometrieanalyse software	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640 medium	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX is afhankelijk van het fluorochroom en YY verschilt per flacon grootte.