Method Article

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

DOI:

10.3791/4269

⸱

October 8th, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling onderzocht In vivo Behulp van genetisch gemanipuleerde muizen op een wildtype of T-celreceptor transgene achtergrond.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gezond immuunsysteem vereist dat T-cellen reageren op vreemde antigenen, terwijl de resterende tolerant voor zelf-antigenen. Willekeurige herschikking van de T cel receptor (TCR) α en β loci genereert een T cel repertoire met enorme diversiteit in antigeenspecificiteit, zowel zelf als buitenlandse. Selectie van het repertoire tijdens de ontwikkeling in de thymus is cruciaal voor het genereren veilige en nuttige T-cellen. Defecten in thymus selectie bijdragen tot de ontwikkeling van auto-en immunodeficiëntie aandoeningen 1-4.

T cel voorlopers voer de thymus als dubbele negatieve (DN) thymocyten die geen expressie CD4 of CD8 coreceptoren. Expressie van het αβTCR en beide co-receptoren optreedt bij de dubbele positieve (DP) podium. Interactie van de αβTCR met zelf-peptide-MHC (pMHC) door thymus cellen bepaalt het lot van de DP thymocyten. Hoge affiniteit interacties leiden tot negatieve selectie en opheffingtie van zelfontledende thymocyten. Lage affiniteit interacties resulteren in positieve selectie en ontwikkeling van CD4 of CD8 enkele positieve (SP) T-cellen herkent vreemde antigenen gepresenteerd door zelf-MHC 5.

Positieve selectie kan worden onderzocht in muizen met een polyklonaal (wildtype) TCR repertoire door het observeren van de generatie van rijpe T-cellen. Zij zijn echter niet geschikt voor de studie van negatieve selectie, die kleine deletie van antigeen-specifieke populaties omvat. Veel modelsystemen zijn gebruikt om negatieve selectie bestuderen maar in hun vermogen om vatten fysiologische gebeurtenissen 6 verschillen. Bijvoorbeeld, in vitro stimulatie van thymocyten mist de thymus omgeving die nauw betrokken is bij selectie, terwijl toediening van exogeen antigen kan leiden tot niet-specifieke deletie van thymocyten 7-9. Op dit moment, de beste tools voor het bestuderen van in vivo negatieve selectie zijn muizen die een transg drukkenENIC TCR specifiek voor endogene zelf-antigeen. Echter, veel klassieke TCR transgene modellen gekenmerkt door premature expressie van het transgene TCRα ketting aan de DN, resulterend in premature negatieve selectie. Ons laboratorium ontwikkelde de HY cd4 model, waarbij de transgene HY TCRα voorwaardelijk wordt aan het DP stadium, waardoor negatieve selectie in de DP optreden SP overgang zoals bij wildtype muizen 10.

Hier beschrijven we een flowcytometrie-based protocol thymus positieve en negatieve selectie onderzoeken de HY cd4 muismodel. Terwijl negatieve selectie in HY CD4 muizen zeer fysiologische Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere TCR transgene modellen. We brengen u ook algemene strategieën voor het analyseren van positieve selectie in een polyklonaal repertoire van toepassing op alle genetisch gemanipuleerde muizen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zie Figuur 1 voor een algemene regeling van het experimentele protocol.

1. Ontleding

  1. Plaats steriele stalen gaas scherm in 60 x 15 mm petrischaal. Een eenheid nodig per weefselmonster.
  2. Voeg 5 ml gebalanceerde zoutoplossing Hank's (HBSS) bij elk gerecht. Houd gerechten op ijs.
  3. Euthanaseren muizen met CO 2.
  4. Secure muis om dissectie oppervlakte, ventrale zijde naar boven. Spray muis met 70% ethanol voor sterilisatie en dat de vacht is gematteerd beneden.
  5. Met behulp van chirurgische schaar, beginnen dissectie door het maken van een ventrale incisie in de buik huid net boven de genitaliën. Verleng de incisie omhoog naar de kin.
  6. Vanaf de middellijn, uitbreiding van de incisie langs alle ledematen. Trek de losse huid en speld het vast aan de dissectie oppervlak.
  7. Oogst de thymus:
    1. Til de onderste punt van het borstbeen tot een incisie te maken.
    2. Het vermijden van de lever, snijd het membraan aan de ribbenkast vervolgens los en snijd de ribbenkast aan elke kant. Snijd de ribbenkast naar boven aan elke kant, zorg ervoor dat de longen en het hart te voorkomen.
    3. Trek voorzichtig aan de ribbenkast terug met een pincet. De thymus is een witte, bilobed orgel boven het hart. Met de platte rand van de forceps naar de bodem van de lobben bevatten, trek de thymus en plaats het op het gaas.
  8. Oogst de milt:
    1. De milt is een rode, surfplank-vormige orgaan in de linkerkant van de abdominale holte muis, onder de lever.
    2. Maak een insnijding in de buikholte. Trek de milt met een pincet, met behulp van het tweede paar te plagen weg bindweefsel. Plaats de milt op een apart mesh zeef.

2. Celpreparaat

  1. Met behulp van een zuiger van een 3 ml spuit-, slijp-organen in de maas scherm totdat alleen het bindweefsel en vet resten. Spoel mesh met HBSS van de schaal driemaal. Gebruik een nieuwe zuiger voor elke weefselmonster.
    1. Andere opties voor homogeniseren weefsel kan worden gebruikt in plaats van deze methode.
  2. Tellen cellen met een hemocytometer.
  3. Pellet cellen door centrifugatie bij 335 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  4. Resuspendeer splenocyten in 500 pi ACK lysis buffer (0,15 M NH4CI, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Resuspendeer thymocyten op 20 x 10 6 cellen / ml in FACS buffer (PBS, 1% FCS, 0,02% natriumazide) en vernietigd op ijs.
  5. Terug splenocyten tot isotoniciteit door toevoeging van 5 ml HBSS. Pellet splenocyten door centrifugeren en resuspendeer in 20 x 10 6 cellen / ml in FACS buffer. Als cellen nodig hebben om te blijven steriel, kunt u gebruik maken steriele RPMI + 10% FCS.

3.Kleurende cellen voor flowcytometrie

Het doel van dit protocol is het schetsen strategieën voor de analyse van positieve en negatieve selectie met wildtype (WT) en HY CD4 muizen. Voor algemene overwegingen met betrekking tot flowcytometrie experimenteel ontwerp, de aankoop, en analyse, verwijzen we de lezers om een uitstekende beoordeling door Tung et al. 11.

  1. Aliquot 4 x 10 6 thymocyten per flowcytometrie monster aan elk putje van een 96-well plaat, en 1 x 10 6 WT splenocyten per compensatie. Bij gebruik van transgene muizen, moet u een WT muis op te nemen als een controle in uw experiment.
  2. Fc-receptoren blokkeren door incubatie cellen met anti-CD16/32 (kloon 2.4G2) gedurende 10 min op ijs.
  3. Spin plaat bij 335 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het deksel en verdrijven vloeistof uit putten door de knop van de plaat een keer, gezicht naar beneden in een gootsteen. Resuspendeer elk putje in 200 ul FACS buffer. Herhaal de was.
  4. Bereid antilichaam cocktails zoals hieronder vermeld, met de optimale concentratie van elk antilichaam gebaseerd op verdunning in 200 ul FACS buffer per well. De optimale concentratie van elk antilichaam wordt gedefinieerd als de laagste concentratie die nodig is om de grootste scheiding van positieve en negatieve populaties geven. Als er geen negatieve populatie van een bepaald antilichaam moet een isotype antilichaam worden opgenomen. Het totale volume per goed kan omlaag geschaald worden (bijv. 100 ul per putje) indien gewenst.
    1. WT thymus: anti-TcR, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 of anti-CD5, anti-CD24
    2. HY CD4 thymus: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 of anti-CD5, anti-CD24
      Betere scheiding van CD69 en CD69 hi lo populaties in thymocyten verkrijgen, wordt aanbevolen dat een gebiotinyleerd anti-CD69 primair antilichaam gebruikt, gevolgd door een secundaire kleuring met fluorochroom-geconjugeerde streptavidine. We Ùse dezelfde strategie voor CD5 kleuring.
  5. Incubeer cellen met 200 pi antilichaam cocktail in FACS buffer gedurende 30 min op ijs in het donker.
  6. Gelijktijdig met antilichaam cocktail vlekken, vlek elk compensatieregeling, met een enkele fluorochroom-geconjugeerd antilichaam. Idealiter compensatie kleuring omvat dezelfde antilichamen in de antilichaam cocktail. Echter kan kleuring voor elk antigen niet haalbaar voor grotere experimenten bij vele antigenen worden getest. Daarom wordt kleuring voor zowel anti-CD4 of anti-CD8 vanwege de hoge expressie van deze antigenen, of het gebruik van compensatie kralen aanbevolen. Vlek in FACS buffer gedurende 30 min op ijs in het donker. Laat een compensatieregeling, ongekleurd.
  7. Was tweemaal cellen met FACS buffer.
  8. Resuspendeer cellen in FACS buffer en transfer naar FACS buizen.
  9. Acquire monsters op flowcytometer. Inclusief aankoop van FSC-A en FSC-W om eenlg voor doublet discriminatie.

4. Analyse van Flowcytometrie gegevens - Niet-TCR transgene muizen

We gebruiken FlowJo voor flowcytometrie analyse. Zie Figuur 2A de gating strategie voor niet-TCR transgene muizen.

  1. Met behulp van FSC-A door het SSC, elektronisch hek aan de "lymfocyt 'bevolking.
  2. Binnen de "lymfocyt" bevolking, gebruik FSC-A door FSC-W om elektronisch hek van de FSC-W lo bevolking naar cel wambuizen en aggregaten van het uit te sluiten. Dit is de "singlet" gate.
  3. Met behulp van de gebeurtenissen in de "singlet" gate, plot CD8 door CD4. Teken poorten voor DN, DP saai, DP heldere, CD4 + CD8 lo, CD4SP en CD8SP populaties zoals weergegeven in figuur 2B.
  4. Onder de CD4SP en CD8SP poorten, maakt u TcR door CD24 percelen. Gebruik het kwadrant gating tool om poorten te trekken zoals afgebeeld in figuur 2C.
  5. Maak een new plot van de "singlet" gate: TcR door CD69. Tekenen poorten A, B, C, D zoals in figuur 2D.
  6. Maak nog een plot van de "singlet" gate: TcR door CD5. Tekenen poorten i, ii, iii, iv zoals in figuur 2E. Dit is een andere strategie voor de behandeling van positieve selectie.
  7. Breng DN, DP saai, DP heldere, CD4 int, CD4SP en CD8SP poorten onder "singlet" om poorten i, ii, iii, iv, A, B, C, D (figuur 2D, E).
  8. Bereken het aantal cellen in een bepaalde subset door vermenigvuldiging orgel cellulariteit door de frequentie van elke volgende poort totdat u uw doelgroep. Bijvoorbeeld het aantal TcR hi-CD69 CD8SP thymocyten wordt bepaald door thymus cellulariteit x% TCR BHI-CD69 (fractie D) x% CD8SP.
    1. Tellen wordt reeds rekening gehouden met de levende en dode cellen dus niet de "lymphocyte "poort in uw berekeningen.

5. Analyse van Flowcytometrie gegevens - TCR transgene muizen

Zie figuur 3A de gating strategie voor TCR transgene muizen.

  1. Volg de stappen 4.1 en 4.2 zoals in de vorige paragraaf.
  2. Onder de "singlet" poort, maakt u een T3.70 door SSC plot en hek aan de T3.70 + celpopulatie om antigeen-specifieke T-cellen (Figuur 3B) te analyseren. In sommige gevallen kan het van belang zijn deze populatie vergelijken met de non-specifieke antigen (T3.70-) T celpopulatie.
  3. Binnen de T3.70 + bevolking, tekenen DN, DP, CD4SP en CD8SP poorten (Figuur 3C).
    1. Voor WT controlemonsters, trekken deze poorten onder de "singlet" gate of maak een T3.70-poort omdat er maar weinig T3.70 + cellen.
  4. Onder de CD8SP poort, maakt u eenT3.70 door CD24 plot. Gebruik het kwadrant gating tool om cellen te verdelen in vier populaties (Figuur 3F).
  5. Een overlay histogram dat CD69 expressie in de DP compartiment van WT muizen en T3.70 + DP compartiment van HY cd4 muizen (Figuur 4A). Herhaal dit om CD5-expressie (Figuur 4B) te onderzoeken.
  6. Bereken het absolute aantal cellen in elke subset plaats als in 4.8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In fysiologische TCR transgene modellen en WT muizen, positieve selectie begint bij de DP heldere stadium vóór het verplaatsen in de DP saaie fase na antigen tegenkomen. DP dof thymocyten voer vervolgens een overgangsperiode CD4 + CD8 lo fase voordat hij CD4SP of CD8SP thymocyten (Figuur 2B). Rijpe thymocyten SP worden gekenmerkt door hoge TCR expressie en verlies van CD24 (Figuur 2C). Terwijl de CD8 door CD4 profiel kan defecten op...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie in niet-transgene en TCR TCR transgene muizen onderzocht. Dit protocol beschrijft de kleuring van oppervlakte-antigenen. Voor verdere analyse van moleculaire mechanismen, is het vaak noodzakelijk om intracellulaire kleuring uitgevoerd. We maken gebruik van de BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit voor de meeste intracellulaire eiwitten en de BD Biosciences Foxp3 Staining Kit voor transcriptiefactoren. We meestal verkrijgen onze monste...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag Bing Zhang bedanken voor zijn technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB is een CIHR New Investigator en AHFMR Scholar. QH wordt ondersteund door een CIHR Canada Graduate Scholarship - Doctoral en een AIHS Voltijds studententijd. SAN wordt ondersteund door een Koningin Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS wordt ondersteund door een NSERC Postgraduate Scholarship - Doctoral.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen (optioneel)
Gebalanceerde zout HyClone Hank's oplossing Thermo Scientific SH30030.02
Metalen gaas schermen Cedarlane CX-0080-E-01
Petrischalen (60 x 15 mm) Fisher Scientific 877221
Spuiten (3 ml) BD Biosciences 309657
Conische buizen (15 ml) Sarstedt 62.554.205
Microscoop Zeiss - Primo Star 415500-00XX-000
Hemocytometer HausserWetenschappelijk 3110
96-well plaat Sarstedt 82.1582.001
Meerkanaalspipet Fisherbrand 21-377-829
Foetaal kalfsserum PAA A15-701
Fosfaat gebufferde zoutoplossing Fisher Scientific SH3025802
Natriumazide IT Baker Chemical Co V015-05
FcR blokkerend reagens Clone 2.4G2
Anti-muis HY TCR eBioscience XX-9930-JJ * Clone T3.70
Anti-muis CD4 eBioscience XX-0042-JJ * Kloon RM4-5
Eennti-muis CD8a eBioscience XX-0081-JJ * Clone 53-6,7
Anti-muis CD24 eBioscience XX-0242-JJ * Clone M1/69
Anti-muis TcR eBioscience XX-5961-JJ * Clone H57-597
Anti-muis CD69 Gebiotinyleerd eBioscience 13 tot 0691-JJ * Clone H1.2F3
Anti-muis CD5 Gebiotinyleerd eBioscience 13-0051-JJ * Clone 53-7,3
Streptavidine eBioscience XX-4217-JJ *
Flowcytometer BD Biosciences - FACS Canto 338962
FACS buisjes BD Biosciences 352052
Flowcytometrieanalyse software TreeStar - Flowjo FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640 medium Thermo Scientific SH30027.01

* XX is afhankelijk van het fluorochroom en YY verschilt per flacon grootte.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
  2. Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
  3. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
  4. Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
  5. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
  6. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
  7. Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
  8. Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
  9. Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
  10. Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
  11. Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
  12. Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
  13. Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
  14. Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
  15. Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
  16. Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
  17. Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23(2010).
  18. Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
  19. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  20. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
  21. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  22. Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  23. Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
  24. Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
  25. Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
  26. Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
  27. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  28. Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
  29. Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  30. Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
  31. Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
  32. Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thymic SelectionFlow CytometryT Cell DevelopmentPositive SelectionNegative SelectionDouble Positive ThymocytesSingle Positive T CellsTCR Transgenic ModelsAntibody Cocktail StainingHYcd4 Mouse Model

Related Articles