Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

15.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4279

⸱

1 december 2012

Erik R. Barthel¹ , Allison L. Speer¹ , Daniel E. Levin¹ , Frédéric G. Sala¹ , Xiaogang Hou¹ , Yasuhiro Torashima¹ , Clarence M. Wigfall¹ , Tracy C. Grikscheit¹

¹Children's Hospital Los Angeles, Division of Pediatric Surgery, Saban Research Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel en de bijbehorende video presenteren ons protocol voor het genereren van weefsel-engineered darm in muizen, waarbij een organoid units-on-scaffold benadering.

Samenvatting

Weefselmanipulatieproducten dunne darm (TESI) is met succes gebruikt om Lewis ratten redden na massale dunne darm resectie, waardoor terugkeer naar preoperatieve gewicht binnen 40 dagen. ¹ in mensen, massieve dunne darm resectie kan resulteren in korte darmsyndroom, functionele malabsorptieve stellen dat significante morbiditeit, mortaliteit en zorgkosten zoals parenterale voeding afhankelijkheid leverfalen en cirrose, en de noodzaak multiviscerale orgaantransplantatie. ² In dit document geeft beschrijven en documenteren ons protocol voor het maken weefselmanipulatieproducten darm in een muismodel met een meercellige organoid eenheden-op-steiger aanpak. Organoid units zijn meercellige aggregaten afgeleid van de darm dat zowel mucosale en mesenchymale elementen bevatten, ³ de relatie tussen die behoudt de intestinale stamcellen niche. ⁴ In lopend en toekomstig onderzoek, de overgang van onze techniek in demuis zal voor onderzoek van de processen in TESI vorming door gebruikmaking van de transgeen materiaal in deze soort. ⁵ De beschikbaarheid van immuungecompromitteerde muizenstammen laat tevens ons de techniek toepassing humane intestinale weefsel en de vorming van menselijke TESI optimaliseren als muis xenograft vóór de overgang naar de mens. Onze methode maakt gebruik van Good Manufacturing Practice (GMP) reagentia en materialen die al zijn goedgekeurd voor gebruik in menselijke patiënten, en biedt daarom een belangrijk voordeel ten opzichte van benaderingen die steunen op gedecellulariseerde dierlijke weefsels. Het uiteindelijke doel van deze methode is de vertaling naar de mens als regeneratieve geneeskunde therapeutische strategie voor short bowel syndrome.

Protocol

1. Organoid Eenheden Voorbereiding

Instrumenten die geschikt is voor de muis dissectie (schaar en pincet) moet worden gesteriliseerd door autoclaaf.
Humaan euthanaseren de donor muis volgens de lokale IACUC protocollen. Zorg ervoor dat het dier dood is voordat u verder gaat.
Een incisie om toegang tot de buikholte krijgen. Huidplooien worden gereflecteerd als nodig om de belichting.
Eviscerate de dunne darm en verdeel het net distaal van het ligament van Treitz. Scheid de dunne darm van de mesenterium met behulp van scherpe en zachte stompe dissectie. Identificeer de Bauhin knooppunt en verdeel de dunne darm 5 mm proximaal van deze.
Met een schaar lengte opent de darm langs de rand antimesenteric in een petrischaal met 10 ml 4 ° C, steriele zoutoplossing Hanks '(HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotica antifungale (Anti-Anti, Invitrogen) oplossing. Wis fecale materie uit de geopende darm metzachtjes schudden vervolgens over geopend darm aan een 15 ml centrifugebuis met 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti.
Was de darm geopend driemaal in 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti in een reageerbuis. Elke wassing kan worden uitgevoerd met mild schudden van de 15 ml buis gedurende 30 sec. Na het schudden het darmweefsel zinkt naar de bodem van de buis. Ontdoen drijvend materiaal dat mesenchymale vuil. Verwijder voorzichtig het wassen oplossing met een pipet.
Hak de gewassen darm in een petrischaal met 10 ml van 4 ° C, steriele HBSS / 1X anti-anti minder dan 1 mm vierkante stukken met een schaar. Verzamel de gehakte materiaal met een automatische pipet en plaats deze in een reageerbuis.
Centrifugeer het buisje bij 500 rpm gedurende 8 min. Verwijder het supernatant, dat vet bevat en mesenchym.
Digereren van het gehakt, gewassen materiaal met 10 ml steriel HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml dispase (Invitrogen) en 800 eenheden / ml collagenase type 1 (Worthington, Lakewood NJ). Aan 40 ml van de spijsvertering oplossing te bereiden afgewogen 5 mg dispase, 142 mg collagenase en voeg steriele HBSS tot een volume van 40 ml. Bereid deze oplossing vers telkens organoid eenheden bereid en houden bij 4 ° C tot gebruik. Voeg de digestieoplossing direct naar de pellet uit stap 1.8.
Incubeer het buisje met het gehakt, gewassen materiaal bij de vertering oplossing bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
Haal de reageerbuis en verder de verteerde weefsel kan verstoren door fijnwrijven met een 10 ml pipet. Herhalen tussen 20 tot 50 keer totdat een uniform uiterlijk wordt verkregen.
Centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 800 rpm. Verwijder het supernatant, dat enkele cellen.
Stop de digestie reactie met 10 ml 4 ° C, steriele Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% v / v hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS, Invitrogen). Resuspendeer de pellet en schud de buis.
Centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 800 rpm. Verwijder voorzichtig het supernatant met een automatische pipet tot de laatste paar druppels. Gebruik een wegwerp plastic pipet voor de laatste paar druppels te voorkomen resuspenderen de pellet.

2. Laden van polyglycolzuur Steiger

Form 2 mm lang en 5 mm buitendiameter cilindrische scaffolds van nonwoven polyglycolzuur (2-mm plaatdikte, 60 mg cm-3 stortgewicht; porositeit> 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) zoals beschreven in Ref. 4.
Knip de distale 2 mm van een wegwerp 1000 microliter pipet tip met een schaar bereid met 70% ethanol in gedestilleerd water.
Plaats de steiger in een 4-well cultuur plaat. Plaats de organoid eenheden op de scaffold met 1000 microliter pipet, eerst in het lumen en op het buitenoppervlak. Gebruik een tang om coating van het lumen te verzekeren. Niet verstoren of open te breken de cilindrische vorm van het polymeer.

3. Implantatie in Host Mouse

Gebruik een syngene gastheer muis op dezelfde achtergrond als de donor indien beschikbaar. Anders, gebruik een immunogecompromitteerde nonobese diabetische / ernstige gecombineerde immunodeficiëntie of NOD / SCID-dier (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
Laten algemene anesthesie met isofluraan. Scheren, prep en drapeer de muis buik.
Maak een 5 mm middellijn incisie om toegang tot de peritoneale holte te krijgen. Identificeer en zorgvuldig uithalen de grotere omentum. Plaats het geladen polymeer op het omentum en wikkel met het weefsel. Niet scheuren het omentum.
Bevestig de polymeer aan het omentum met een 5-0 hechting monocryl. Voorzichtig vervangen omentum de verpakte polymeer in de anatomische positie.
Sluit de abdominale incisie in lagen met 4-0 vicryl hechtingen. Voer de spier sluiting en let op dat de buikorganen onder de incisie verwonden. Gebruik onderbroken hechtingen voor de huid.
Dien postoperatieve analgesie met 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in steriel water als subcutane wheal naast de insnijding. Proefdieren moeten dagelijks worden geëvalueerd en indien het dier te tonen tekenen van pijn of ongemak, een bijkomende dosis van ketoprofen kunnen worden toegediend op post-operatieve dag 2. Door de derde postoperatieve dag, moet het dier volledig worden hersteld zonder bewijs van pijn of ongemak. Als pijn of angst gaat verder op post-operatieve dag 3, wordt dit beschouwd als abnormaal en moet worden behandeld in overeenstemming met de IACUC en verzorging van dieren faciliteit protocollen.
Laat de muis om te herstellen en het weefsel vervaardigde darm te groeien gedurende vier weken. Geef het dier ad libitum toegang tot knaagdier chow (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis, MO) en water met Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) bij 1:100 verdunning.

4. Oogst

HumaNely euthanaseren de host dier vier weken na de implantatie.
Open de oorspronkelijke incisie en geven de huid craniale toegang tot de buikholte vergemakkelijken.
Open de spierlaag en identificeren van de tissue-engineering construct zoals een bol van weefsel.
Take down verklevingen aan het construct van intra-abdominale ingewanden met behulp van scherpe dissectie.
Bevestig het construct in formaline voor later paraffine montage of gebruik het weefsel vers voor biochemische assays, zoals real-time PCR of eiwit isolatie.