Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

Samenvatting

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Samenvatting

De wortel fungeert als fysische anker van de plant en het orgaan verantwoordelijk voor opname van water en minerale nutriënten zoals stikstof, fosfor, sulfaat en sporenelementen installaties meten van de grond. Willen we een duurzame aanpak te ontwikkelen voor het produceren van hoge gewasopbrengst, moeten we beter begrijpen hoe de wortel ontwikkelt, neemt een breed spectrum van voedingsstoffen en interactie met symbiotische en pathogene organismen. Om deze doelen te bereiken, moeten we in staat zijn om wortels in microscopisch detail te onderzoeken na verloop van tijd een periode variërend van minuten tot dagen.

We hebben de RootChip, een polydimethylsiloxaan (PDMS) - op basis van microfluïdische apparaat, die ons in staat om te groeien en beeld wortels van Arabidopsis zaailingen zonder dat dit fysieke stress naar de roots van tijdens de voorbereiding van beeldvorming ¹ (figuur 1). Het apparaat bevat een gespleten kanaal structuur met micromechanische kleppen om de vloeistofstroom te begeleidenuit de oplossing inlaten elk van de acht waarneming kamers ^2. Dit perfusie systeem maakt het mogelijk de wortel micro-omgeving te worden gecontroleerd en aangepast met precisie en snelheid. Het volume van de kamers is ongeveer 400 nl, waarvoor derhalve slechts minimale hoeveelheden meetoplossing.

Hier bieden wij u een gedetailleerd protocol voor het bestuderen van wortel biologie op de RootChip met behulp van imaging-gebaseerde benaderingen met real-time resolutie. Roots kan worden geanalyseerd over een aantal dagen met behulp van time-lapse microscopie. Wortels kunnen worden geperfuseerd met voedingsoplossingen of remmers, en tot acht zaailingen kunnen worden geanalyseerd in parallel. Dit systeem heeft het potentieel voor een breed scala aan toepassingen, waaronder de analyse van wortelgroei in de aanwezigheid of afwezigheid van chemicaliën, fluorescentie-gebaseerde analyse van genexpressie, en de analyse van biosensoren, bijvoorbeeld FRET nanosensoren ^3.

Protocol

Opmerking: Voer alle stappen die voorbereidende stappen onder steriele omstandigheden.

1. Voorbereiding van kunststof Cones voor kiemende zaden

1. Vul een 10 cm Petrischaal met groeimedium bevattende 1% agar tot een dikte van 5 mm. We gebruiken een halve kracht aangepast Hoagland medium ^4, maar medium samenstelling moet worden gekozen om de individuele experimentele eisen.
2. Hoewel het medium nog vloeibaar een multi-kanaal pipet 10 pi pipetpunten vullen met 5 pi medium van de petrischaal.
3. Bewaar de gevulde tips in de pipetpunt box tot het medium is solide, snijd tot 4 mm lange plastic kegels en plaats rechtop in een petrischaal met een solide groei medium.

2. Zaadkieming en de groei van zaailingen

1. Ondergrond steriliseren zaden in 5% NaOCl gedurende 5 minuten, drie keer wassen met steriel water, plaats dan een enkel zaad op de top van elk van de midden-gevulde kegels.
2. Sluit de schotel met Micropore tape (3M) en bewaar bij 4 ° C tot kieming te synchroniseren.
3. Na drie dagen, over te dragen de platen tot een groei kast om kieming te starten. Onze groei voorwaarden zijn van 23 ° C bij een 16u hoge light/8h donker cyclus (lichtintensiteit: 100 μE m ^-2 s ^-1).
4. Tussen 5 en 7 dagen na kieming moet de zaailingen klaar voor overdracht naar de RootChip. Op dit moment moet wortelpuntjes dicht bij de bodem uitlaten van de plastic kegels. Controleer zaailing gezondheid, wortel lengte en, indien van toepassing, de expressie van een fluorescente marker onder een stereomicroscoop.
5. Markeer afzonderlijke zaailingen voor de transfer op de chip. Selecteer een tiental zaailingen in het geval een beschadigd tijdens de overdracht.

3. Overdracht van Zaailingen op de RootChip

1. Om de RootChip voor de lange termijn experimenten steriliseren, wikkelhet apparaat in vloeipapier, plaats in een glazen petrischaal en autoclaaf.
2. Zodra de RootChip is afgekoeld, dek het af met vloeibaar groeimedium. De RootChip moet volledig worden ondergedompeld, maar de vloeistof mag niet meer dan 3 mm boven het RootChip oppervlak.
3. Met een 20 ui pipet, trek medium door de wortel inlaat-en kamer-uitgang aan de observatie kamer te vullen met medium.
4. Plug plastic kegels geselecteerd in stap 2.5 in de RootChip inlaten. De kegels moet goed passen in de inlaten. Aangezien de RootChip is gemonteerd op een dunne laag optisch glas, niet te veel druk uit op de chip.
5. Incubeer de RootChip een nacht in vloeibaar medium. Om te voorkomen dat zwevende, plaatsen twee glazen dia's op de chip. Voeg een magnetische roerstaaf en sluit de schotel.
6. Breng het samenstel op een magnetische roerder en Schud de medium.
7. De RootChip de inhammen snijden de kanalen in een hoek van 30 ° om het apparaat normaal FACIlitate wortelgroei in de kanalen (figuur 1A). Ter ondersteuning groei in de gewenste richting, kantelt de montage door een glasplaatje onder petrischaal aan de zijde van de chip tegenover de uitlaten.
8. Om de licht / donker cyclus te behouden, verlichten de zaailingen met een ring lamp (Lichtsterkte: 100 μE m ^-2 s ^-1) aangesloten op een timer.

4. Aansluiten van de RootChip aan de Vervoerder

1. De volgende dag, vul een afsluitbaar, pressurizable flesje met vloeibare groeimedium (Figuur 1B).
2. Keer de chip drager en plaats deze op een stabiele ondergrond. Verwijder de RootChip van de vloeistof en breng het PDMS kant naar beneden in de onderste opening van de chip-drager. Plaats de chip zodat de zijde met de controle laag inhammen wordt geconfronteerd met de kant van de drukleiding Slangconnectoren in de drager zijwand.
3. Droog het dekglas deonderkant van de chip door zachtjes te deppen met vloeipapier. Bevestig de RootChip aan de vervoerder met tape en rechts het geheel.
4. Slangconnectoren worden gemaakt door het snijden van flexibele kunststof microbore buis (Tygon, 0,20 "ID x 0.060" OD) in 5 cm lange stukken en verbinden van roestvrij staal microbore buizen (New England Small Tube, 0,025 "OD x 0,013" ID x 0,75 " lang). Vul de slang aansluitingen met water met behulp van een spuit en sluit elke slangen connector in de overeenkomstige bestrijdingsprogramma laag inlaat op de chip. Het water zal later vullen de controle laag kanalen en worden gebruikt om de druk om de micromechanische kleppen te verzenden.
5. Steek de andere uiteinden van de lijnen in de media / flesje (s). Oefen druk uit op de oplossing flacon met een spuit lucht. De verhoogde luchtdruk in de flesje dwingt vloeistof in de leidingen.

5. Montage van de RootChip aan de microscoop

1. Plaats de drager op de Microscope podium. Om de mogelijkheid van het samenstel verschuiving gedurende het experiment door trillingen in de kamer te verminderen wordt de drager precies in de uitsparingen van de fase inzetstuk.
2. De chip kleppen en de mediumstroom door de chip worden bestuurd door de luchtdruk. Twee lijnen met regelaars afgetakt een hoofd drukleiding - een wordt gebruikt om de mediumstroom door de kanalen controleren en de andere is verbonden met elektro-pneumatische kleppen die de push-up kleppen van de controle laag bedienen. De magneetventielen worden bediend vanuit de computer via de USB-afsluiterbesturing (ontwikkeld door Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Sluit beide drukregelaars voordat u de chip.
3. Voeg een paar ml water aan de reservoirs van de drager te houden de luchtvochtigheid hoog in de gemeente. Deze stap moet worden herhaald loop van meer experimenten om de planten niet uitdrogen. Houd het volume laag om t te minimaliserenhij hoeveelheid vloeistof kunnen worden gemorst de microscoop. Voor de lange termijn experimenten, kan de uitstroom uit de chip verkooppunten worden geleid in de reservoirs van de drager door het aansluiten van de chip verkooppunten aan de reservoirs met microbore buis (zie stap 4.4). Alternatief kan de uitstroom dat zich op de chip oppervlak verzameld pipetteren.
4. Bereid vierkante vellen doorzichtig plastic vel van beschermers (C-Line). Bevestig de doorzichtige plastic aan de vervoerder door de dubbelzijdige tape om een ​​hoge luchtvochtigheid in de vergadering te houden.
5. Plaats de ring licht over de chip en onderhouden van de licht / donker cyclus. De ring licht dient te worden uitgeschakeld voor de start van een experiment dat fluorescerende merkers gebruikt, omdat de directe verlichting zal interfereren met foto collectie.

6. Bediening van de RootChip het gebruik van de LabView-interface

De RootChip controller interface voor de LabView software platform kanworden gedownload van onze website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

1. De kleppen op de chip zijn gesloten door druk op de controle laag, in dit geval door de elektro-pneumatische kleppen. De controller interface maakt de bediening van de kleppen door te klikken op de knop onder de klep nummer. Heldergroene geeft van druk en sluiten van een klep chip (Figuur 2B). Activeer alle drie de oplossingsgerichte inlaatkleppen in de controller-interface voor het openen van de drukregelaars. Opmerking: De controller interface heeft een feedback-lus, die de controle van de status van het systeem mogelijk maakt. Deze functie kan worden geactiveerd door te klikken op de "readback" knop in de controller interface.
2. Open de drukregelaar voor de controle op laag en in eerste instantie ingesteld op 15 psi, open dan de regulator voor de stroom laag en in eerste instantie ingesteld op 5 psi. Afhankelijk van het gewenste debiet, kan de druk later worden aangepast.
3. Open de inlaatklep voor de groei medium bij uitstek om de kamers spoelen met medium.
4. Controleer afgifte paden onder de microscoop. Gewoonlijk wordt lucht in de stromingskanalen en moet worden verwijderd. Bovendien is de kanalen van de controle laag bevatten nog lucht die moet worden gedwongen en vervangen door het water uit de buis connectors (doodlopende vulling). Beide taken worden bereikt door spoelen elk van de acht kamers aantal (5 psi) tot alle lucht wordt uit de kanalen in de PDMS ("ontgassen"). Opmerking: De controller interface kan geprogrammeerd worden om experimenten te automatiseren. Dergelijke routines kunnen ook worden gebruikt om ontgas de chip.

7. Representatieve resultaten

Het belangrijkste doel van de RootChip is om een ​​imaging platform en een perfusie-systeem in een enkel apparaat te combineren met een hoge mate van integratie. Om de manipulatie aan te tonenvan de micro-omgeving van de wortels gespoeld we de kamers met donkere kleurstof (1:4 verdunning in hydrocultuur medium) en gemeten de uitwisseling van vocht in de kamers. Bij de aanbevolen druk van 5 psi we gemeten volledige uitwisseling binnen 10 seconden bij een berekende debiet van ongeveer 1,5 pl / min (figuur 3).

Ook waargenomen wortelgroei zaailingen, in dit geval gekweekt in het donker en voorzien 10 mM glucose als externe energiebron (figuur 4). Afhankelijk van de groeicondities zoals licht en samenstelling van het medium, kunnen planten worden waargenomen in de RootChip tot drie dagen.

De RootChip is gebruikt om intracellulaire glucose en galactose niveaus wortels expressie genetisch gecodeerd nanosensoren, gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ^5-7 volgen. Wortels in de chip werden geperfuseerd met vierkante pulsen van glucose of galactose-oplossing ( Figuur 5). De intracellulaire niveau van suikers werden gecontroleerd en hier uitgedrukt als een verhouding van de intensiteit van de acceptor fluorofoor Citrine de intensiteit van de donor ECFP. De stijging van de ratio geeft ophoping van suiker.

Figuur 1. RootChip principe.

1. De RootChip beschikt over acht observatie kamers voor de groei en de beeldvorming van wortels. De zaden eerst ontkiemen in een plastic kegels - vervaardigd uit plastic pipet tips - die gevuld zijn met een vast medium. De wortel tip groeit door het medium en bereikt de kamer waar een continue stroom van vloeibaar medium houdt de voorwaarden in de kamer constant. Micromechanische kleppen (rood) de stroom. De chip is aangebracht op een optische dekglas.
   Tekening niet op schaal. (Aangepast met toestemming van Grossmann et al.., 2011 Plant Cell.)
2. SchEME van een pressurizable flesje met membraan (rood).

Figuur 2. Aansluiten en monteren RootChip.

1. Bovenaanzicht van de volledig verbonden RootChip en drager gemonteerd op een omgekeerde microscoop.
2. Schema illustreren de kleppensysteem en de controller interface. Een voorbeeld van een klep instellen van de fluïdumstroming leiden naar een kamer wordt. Hoewel kleppen 4 tot 8 fungeren als een, kleppen 0 tot 3 handeling groepen. Met dit systeem een ​​afzonderlijke ruimte kunnen worden aangepakt door het activeren van een combinatie van kleppen.

Figuur 3. Uitwisseling van oplossingen in de observatie lAmbers. Visualisatie van de uitwisseling van vocht in een observatie-kamer met behulp van kleurstof oplossing. Het beeld is een overlay van helderveld en valse kleuren intensiteit van de kleurstof signaal.

Figuur 4. On-chip wortelgroei. Observatie van een groeiende wortel uiting van een fluorescerende FRET nanosensor voor glucose / galactose in de loop van 20u. Tijd formaat: uu: mm, schaal bar: 100 urn.

Figuur 5. Het meten van intracellulaire suiker niveaus met behulp van FRET nanosensoren.

1. De hoeveelheid sensor wordt als citrien intensiteit in de wortelpuntje (links). De reactie van de intracellulaire FRET nanosensor de toepassing van glucose of galactose oplossing wordt als ratiometrische beelden. (Aangepast met toestemming van Grossmann et al.., 2011 Plant Cell) Schaal bar:. 100 micrometer.
2. Volgen FRET verhouding verandert als reactie op drie herhaalde vierkante pulsen van glucose (groen) en galactose (rood).

Discussie

De belangrijkste voordelen van de RootChip groei ten opzichte van conventionele methoden zijn de minimaal invasieve voorbereiding voor microscopie, de mogelijkheid om reversibel en herhaaldelijk af aan het wortelmilieu, en de capaciteit voor continue observatie van ontwikkelingsgebied bevoegde en fysiologisch gezond weefsel gedurende een periode van meerdere dagen. Vroeger werden zaailingen verticaal gegroeid op gegeleerde media en overgebracht naar een perfusiesysteem onmiddellijk vóór de proef, waardoor alleen het meten een wortel tegelijk ^8. Microfluïdische middelen zijn gebruikt Arabidopsis, maar op een laag niveau integratie ⁹ of zonder perfusie regelaar ^10. De RootChip combineert een hoge mate van integratie met de mogelijkheid om experimenten te automatiseren door middel van een zeer nauwkeurige begeleiding. Een ander voordeel van dit platform kenmerk van microfluïdische apparaten ^11, dat slechts minimale hoeveelheden vloeistof moeten de wortel voorzien van de nodige moerRients, zelfs voor experimenten verspreid over meerdere dagen. De RootChip is momenteel ontworpen als een gebruiksvriendelijk apparaat, maar aangezien de productiekosten van chips zijn laag, de kleine hoeveelheden van de verbruikte reagentia maakt de chip nog steeds zeer rendabel.

Er zijn enkele kritische stappen worden genomen om de gezondheid van de zaailingen waarborgen:

Het volume in de kunststof kegels slechts 3-4 pi, die beginnen te drogen bij blootstelling aan lucht. Daarom is het essentieel dat de kegels worden overgebracht snel op de chip en de luchtvochtigheid is hoog gehouden tot aan de wortels hebben bereikt de observatie kamers, die hen zal voorzien van voldoende water. Stappen 4,2 tot 4,5 dient snel en zonder onderbreking het drogen van de zaailingen voorkomen worden.

Stappen 3,5 tot 3,8 beschrijven de incubatie van de chip in vloeibare media waarin de wortels groeien in de waarneming kamers. Deze stap kan worden overgeslagen montage van de chip in de carrier onmiddellijk en het starten van een constante perfusie met groeimedium. Toch raden wij onderdompelen in groeimedium 's nachts, want het heeft een aantal voordelen: 1) het creëert een vochtige omgeving, zodat de zaailingen minder snel gedroogd als ze groeien in de observatie kamer, 2) de chip wordt geweekt in vloeistof, zodat ontgassing (stap 6.4) zal sneller zijn.

Het is belangrijk media met lage concentraties opgeloste stof. Meer geconcentreerde oplossingen kan neerslaan en verstoppen de kanalen, vooral als de chip wordt gedurende meerdere dagen.

Wanneer het apparaat is verbonden met de luchtdruk lijn wordt mediumstroom geregeld door het veranderen hydraulische druk in de kleppen. Om te garanderen goede sluiting van de microbladveren kleppen is belangrijk om een ​​stuurdruk die ongeveer driemaal hoger dan de waterdruk. De waterdruk niet meer dan 15 psi de vloeistof wordt geduwd van de wortel inlaten. Hogere drukken may ook leiden delaminatie van de chip, die de chip onbruikbaar maakt.

Een beperking van de RootChip dat PDMS is poreus en hydrofoob. Hoewel het materiaal nagenoeg inert aan waterige oplossingen, kan absorberen organische verbindingen ^12. Dit kan interfereren met een snelle uitwisseling van oplossingen organische verbindingen kunnen lekken van het materiaal zelfs wanneer de toevoer van deze verbinding is gestopt bij de inlaat. Door de porositeit kan met organische oplosmiddelen opzwellen van de PDMS ^12.

Wij blijven de RootChip optimaliseren en het nut verlengen, bijvoorbeeld met wortels van gewassen. Wij geloven dat door het verbeteren van de toegang tot de wortel voor behandelingen en observatie, microfluïdische tools zoals de RootChip zal leiden tot nieuwe dimensies van wortel onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Items	Bron	Informatie
Chip carrier, software en andere informatie.	Carnegie Institution - DPB	CAD en CNC bestanden voor carrier fabricage, controller software en verdere informatie zijn te downloaden vanaf de website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers kunnen ook worden besteld via deze website.
RootChip	Stanford Gieterij	Masker ontwerpen en de fabricage protocollen zijn beschikbaar op aanvraag. Kant-en-klare RootChips kunnen worden besteld bij http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip-controller	-Home ingebouwde	Het geautomatiseerde afsluiterbesturing systeem is oorspronkelijk ontwikkeld door Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab. Een gedetailleerde instructies hoe je je eigen bediende klep controller te bouwen is te vinden op https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers