Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

12.8K weergaven

DOI:

10.3791/4294

28 december 2012

In dit artikel

Samenvatting

Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op andere In vivo Modellen van menselijke ziekten.

Samenvatting

In de kern bevinden de proteomen waarvan de functies zijn het meest nauw verbonden met de genregulatie. Volwassen zoogdier cardiomyocyte kernen zijn uniek vanwege het hoge percentage binucleaire cellen, de overwegend een heterochromatine toestand van het DNA en de niet-delende aard van de cardiomyocyt waarin volwassen kernen maakt in een permanente staat van interfase. Twee Transcriptionele regulatie tijdens de ontwikkeling en ziekte zijn goed bestudeerd in dit orgaan, 3-5 maar wat blijft relatief onontdekt is de rol van de nucleaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor DNA verpakking en expressie, en hoe deze eiwitten veranderingen in transcriptie's die tijdens ziekte te bestrijden. 6 In de ontwikkelde wereld, hart-en vaatziekten is de nummer een doodsoorzaak voor zowel mannen als vrouwen. 7 Inzicht in hoe nucleaire eiwitten samen te werken om de progressie van deze ziekte te reguleren is van cruciaal belang voor het bevorderen van de huidige behandeling oOPTIES.

Massaspectrometrie is de ideale tool voor het aanpakken van deze vragen omdat het zorgt voor een onpartijdige annotatie van de nucleaire proteoom en de relatieve kwantificatie voor de manier waarop de overvloed van deze eiwitten verandert met de ziekte. Hoewel er verschillende proteomics studies voor zoogdieren nucleaire eiwit-complexen, 8-13 tot voor kort 14 is er slechts een studie naar de cardiale nucleaire proteoom, en zij van mening was de hele kern, in plaats van het verkennen van het proteoom op het niveau van de nucleaire sub compartimenten 15. In groot deel is dit gebrek aan werk te wijten aan de moeilijkheid van het isoleren van cardiale kernen. Cardiac kernen optreden binnen een starre en dichte actine-myosine inrichting waaraan zij verbonden via meerdere verlengingen van het endoplasmatisch reticulum, voorzover myocyte contractie verandert bovendien hun algemene vorm. 16 cardiomyocyten zijn 40% mitochondria vol 17 die necessitates verrijking van de kern naast de andere organellen. Hier beschrijven we een protocol voor cardiale nucleaire verrijking en verdere fractionering in biologisch relevante compartimenten. Verder hebben we detail werkwijzen voor label-free kwantitatieve massaspectrometrische dissectie van deze fracties-technieken vatbaar voor in vivo experimenten in verschillende diermodellen en orgaansystemen waar metabolische labeling niet haalbaar.

Protocol

De experimentele workflow bevat zeven belangrijke stappen (Figuur 1). Voor alle werkzaamheden waarbij monsters die zullen worden uitgevoerd op de massaspectrometer, moet er worden dragen een laboratoriumjas, handschoenen en haarnetje en zorg om besmetting tegen stof en persoonlijke vergieten van keratine te voorkomen.

1. Hart Homogenisatie en nucleaire Isolatie

Muis harten gehomogeniseerd en een intacte kernen pellet wordt geïsoleerd (Figuur 2).

  1. Sacrifice volwassen muis, accijnzen het hart, spoel in ijskoud PBS, en homogeniseren op ijs in glas dounce (wij geven de v....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 4 benadrukt het nut van deze vorm van relatieve kwantificatie. Getoond in het linker paneel zijn de individuele mono-isotopische peptide pieken (bedekt met verschillende muizen), die zijn aangewezen als behorend tot het eiwit HMGB1 (geïdentificeerd via database). Elke piek in wezen een ionenchromatograaf geëxtraheerd voor de gegeven peptide afkomstig is van een andere muis. De groepen vertegenwoordigen drie verschillende fysiologische toestanden: basale, cardiale hypertrofie en hartfalen, met dri.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Twee methoden voor nucleaire isolatie eerder zijn beoordeeld: 27 men de techniek van Behrens homogeniseren gelyofiliseerd weefsel in een niet-waterig oplosmiddel en de tweede een wijziging waarvan we hier homogeniseren van weefsel in een waterige sucrose / zoutoplossing gevolgd door differentiële of dichtheid-gradiënt centrifugatie.

Subfractionation van de kernen door zure extractie op weefselmonsters is een belangrijk instrument voor het bestuderen van chromatine die is sinds 196.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

De Vondriska lab wordt ondersteund door subsidies van de National Heart, Lung and Blood Institute van de NIH en de Laubisch Endowment aan de UCLA. EM is ontvanger van de Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship voor de Fysiologie aan de UCLA, HC is de ontvanger van een American Heart Association Pre-doctorale beurs, MP is de ontvanger van een NIH Ruth Kirschstein post-doctorale beurs, en SF is de ontvanger van een NIH K99 Award.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer
Dulbeco Modified Eagle Medium Invitrogen 11965
Protease pellet Roche 04 693 159 001
100 um zeef BD Falcon 352360
Ultracut ultramicrotoom Reichert
100CX Transmissie Elektronen
Microscoop
JEOL USA, Inc
Wielewaal BioRad 161-0496
Histon H2A antilichaam Santa Cruz sc-8648
Nucleoporin p62 antilichaam BD Biosciences 610498
Adenine nucleotij transporter antilichaam Santa Cruz sc-9299
BiP antilichaam Santa Cruz sc-1050
Tubuline antilichaam Sigma T1568
Histon H3 antilichaam Abcam ab1791
Fibrillarin antilichaam Cell Signaling C12C3
SNRP70 antilichaam Abcam ab51266
E2F-1 antilichaam Thermo Fisher MS-879
Retinoblastoom antilichaam BD Biosciences 554136
Hypoxie induceerbare factor-1 antilichaam Novus Biologicals NB100-469
BCA eiwitbepaling Thermo Scientific 23227
Omgekeerde fasekolom Nieuwe Objectief PFC7515-B14-10
BioWorks Browser Thermo Scientific

Referenties

  1. Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
  2. Rumyantsev, P. P.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Chromatinoproteoomanalysecardiale nucleaire verrijkingnucleaire subfractioneringlabelvrije massaspectrometriehistone extractiekwantitatieve proteomicsvergelijking van ziektestatusprofilering van het nucleaire proteoomchromatinebindende eiwittenmuizenhartkernen