Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op andere In vivo Modellen van menselijke ziekten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de kern bevinden de proteomen waarvan de functies zijn het meest nauw verbonden met de genregulatie. Volwassen zoogdier cardiomyocyte kernen zijn uniek vanwege het hoge percentage binucleaire cellen, de overwegend een heterochromatine toestand van het DNA en de niet-delende aard van de cardiomyocyt waarin volwassen kernen maakt in een permanente staat van interfase. Twee Transcriptionele regulatie tijdens de ontwikkeling en ziekte zijn goed bestudeerd in dit orgaan, 3-5 maar wat blijft relatief onontdekt is de rol van de nucleaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor DNA verpakking en expressie, en hoe deze eiwitten veranderingen in transcriptie's die tijdens ziekte te bestrijden. 6 In de ontwikkelde wereld, hart-en vaatziekten is de nummer een doodsoorzaak voor zowel mannen als vrouwen. 7 Inzicht in hoe nucleaire eiwitten samen te werken om de progressie van deze ziekte te reguleren is van cruciaal belang voor het bevorderen van de huidige behandeling oOPTIES.
Massaspectrometrie is de ideale tool voor het aanpakken van deze vragen omdat het zorgt voor een onpartijdige annotatie van de nucleaire proteoom en de relatieve kwantificatie voor de manier waarop de overvloed van deze eiwitten verandert met de ziekte. Hoewel er verschillende proteomics studies voor zoogdieren nucleaire eiwit-complexen, 8-13 tot voor kort 14 is er slechts een studie naar de cardiale nucleaire proteoom, en zij van mening was de hele kern, in plaats van het verkennen van het proteoom op het niveau van de nucleaire sub compartimenten 15. In groot deel is dit gebrek aan werk te wijten aan de moeilijkheid van het isoleren van cardiale kernen. Cardiac kernen optreden binnen een starre en dichte actine-myosine inrichting waaraan zij verbonden via meerdere verlengingen van het endoplasmatisch reticulum, voorzover myocyte contractie verandert bovendien hun algemene vorm. 16 cardiomyocyten zijn 40% mitochondria vol 17 die necessitates verrijking van de kern naast de andere organellen. Hier beschrijven we een protocol voor cardiale nucleaire verrijking en verdere fractionering in biologisch relevante compartimenten. Verder hebben we detail werkwijzen voor label-free kwantitatieve massaspectrometrische dissectie van deze fracties-technieken vatbaar voor in vivo experimenten in verschillende diermodellen en orgaansystemen waar metabolische labeling niet haalbaar.
Protocol
De experimentele workflow bevat zeven belangrijke stappen (Figuur 1). Voor alle werkzaamheden waarbij monsters die zullen worden uitgevoerd op de massaspectrometer, moet er worden dragen een laboratoriumjas, handschoenen en haarnetje en zorg om besmetting tegen stof en persoonlijke vergieten van keratine te voorkomen.
1. Hart Homogenisatie en nucleaire Isolatie
Muis harten gehomogeniseerd en een intacte kernen pellet wordt geïsoleerd (Figuur 2).
- Sacrifice volwassen muis, accijnzen het hart, spoel in ijskoud PBS, en homogeniseren op ijs in glas dounce (wij geven de v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 4 benadrukt het nut van deze vorm van relatieve kwantificatie. Getoond in het linker paneel zijn de individuele mono-isotopische peptide pieken (bedekt met verschillende muizen), die zijn aangewezen als behorend tot het eiwit HMGB1 (geïdentificeerd via database). Elke piek in wezen een ionenchromatograaf geëxtraheerd voor de gegeven peptide afkomstig is van een andere muis. De groepen vertegenwoordigen drie verschillende fysiologische toestanden: basale, cardiale hypertrofie en hartfalen, met dri.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Twee methoden voor nucleaire isolatie eerder zijn beoordeeld: 27 men de techniek van Behrens homogeniseren gelyofiliseerd weefsel in een niet-waterig oplosmiddel en de tweede een wijziging waarvan we hier homogeniseren van weefsel in een waterige sucrose / zoutoplossing gevolgd door differentiële of dichtheid-gradiënt centrifugatie.
Subfractionation van de kernen door zure extractie op weefselmonsters is een belangrijk instrument voor het bestuderen van chromatine die is sinds 196.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De Vondriska lab wordt ondersteund door subsidies van de National Heart, Lung and Blood Institute van de NIH en de Laubisch Endowment aan de UCLA. EM is ontvanger van de Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship voor de Fysiologie aan de UCLA, HC is de ontvanger van een American Heart Association Pre-doctorale beurs, MP is de ontvanger van een NIH Ruth Kirschstein post-doctorale beurs, en SF is de ontvanger van een NIH K99 Award.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 um zeef | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotoom | Reichert | ||
| 100CX Transmissie Elektronen Microscoop | JEOL USA, Inc | ||
| Wielewaal | BioRad | 161-0496 | |
| Histon H2A antilichaam | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antilichaam | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotij transporter antilichaam | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antilichaam | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubuline antilichaam | Sigma | T1568 | |
| Histon H3 antilichaam | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antilichaam | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antilichaam | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antilichaam | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoom antilichaam | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxie induceerbare factor-1 antilichaam | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA eiwitbepaling | Thermo Scientific | 23227 | |
| Omgekeerde fasekolom | Nieuwe Objectief | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
Referenties
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
