Het visualiseren van Bacteriën in Nematoden met behulp van fluorescentie microscopie

Summary

Om de mutualisme tussen studeren Xenorhabdus Bacteriën en Steinernema Nematoden, methoden ontwikkeld om bacteriële aanwezigheid en locatie binnen nematoden volgen. De experimentele benadering, die kan worden toegepast op andere systemen, houdt techniek bacteriën het groen fluorescent eiwit en visualiseren expressie, met fluorescentiemicroscopie bacteriën in de transparante nematode.

Abstract

Symbiose, het samenleven van twee of meer organismen, zijn wijdverspreid in alle koninkrijken van het leven. Als twee van de meest gebruikte organismen op aarde, nematoden en bacteriën vormen een breed scala van symbiotische associaties die variëren van gunstig pathogene ^1-3. Een van deze vereniging is de wederzijds voordelige relatie tussen Xenorhabdus bacteriën en Steinernema nematoden, die zich ontpopt als een modelsysteem van symbiose ^4. Steinernema nematoden zijn entomopathogene, met behulp van hun bacteriële symbiont te doden insecten ^5. Voor overdracht tussen insect gastheren, de bacteriën koloniseren de darm van besmettelijke de nematode de juveniele fase ^6-8. Onlangs hebben diverse andere nematode species aangetoond bacteriën gebruiken insecten te doden ^9-13, en onderzoeken begonnen onderzoeken van de interacties tussen de nematoden en bacteriën in deze systemen <sup> 9.

We beschrijven een werkwijze voor visualisatie van een bacteriële symbiont in of op een nematode gastheer te maken van de optische transparantie van nematoden wanneer bekeken door microscopie. De bacteriën zijn ontworpen om een ​​fluorescent eiwit tot expressie, zodat de visualisatie met fluorescentiemicroscopie. Veel plasmiden beschikbaar die dragen genen die coderen voor eiwitten die fluoresceren bij verschillende golflengten (bijvoorbeeld rood of groen), en conjugatie van plasmiden van een donor Escherichia coli-stam in een ontvanger bacteriële symbiont is succesvol voor een groot aantal bacteriën. De beschreven methoden zijn ontwikkeld om de associatie tussen Steinernema carpocapsae en Xenorhabdus nematophila ¹⁴ te onderzoeken. Soortgelijke methoden zijn gebruikt om andere nematode-bacterie associaties ^{9, 15-18} onderzoeken en de aanpak derhalve algemeen toepasbaar is.

The Method maakt karakterisering van bacteriële aanwezigheid en lokalisatie binnen nematoden in verschillende stadia van ontwikkeling, het verstrekken van inzicht in de aard van de vereniging en het proces van kolonisatie ^{14, 16, 19.} Microscopische analyse onthult zowel kolonisatie frequentie binnen een populatie en lokalisatie van bacteriën gastheerweefsels ^{14, 16, 19-21.} Dit is een voordeel ten opzichte van andere methoden om bacteriën in nematode populaties, zoals sonicatie ²² of slijpen ^23, welke kan gemiddelde niveau van kolonisatie, maar mag bijvoorbeeld populaties onderscheid met een hoge frequentie van laag symbiont ladingen van populaties met een lage frequentie van hoge belastingen symbiont. Discrimineren de frequentie en belasting van koloniserende bacterie kan vooral van belang bij het ​​screenen of het karakteriseren van bacteriële kolonisatie mutanten fenotypes ^{21, 24.} Inderdaad, fluorescentie microscopie gebruikt in high throughput screening van bacteriële mutanten voor gebreken in kolonisatie ^{17, 18,} ​​en is minder arbeidsintensief dan andere methoden, zoals sonicatie ^{22, 25-27} en individuele nematode dissectie ^{28, 29.}

Protocol

1. Bouw van een TL-bacteriestam via Vervoeging

1. Grow de ontvangende stam (symbiont te onderzoeken) en donorstam 's nachts. De donor stam, gewoonlijk Escherichia coli, moeten kunnen doneren DNA via conjugatie en worden getransformeerd met een plasmide (Tabel 2) dat een gen dat codeert voor een fluorescent eiwit draagt. Afhankelijk van het plasmide kan een conjugatie helper stam ook nodig. Als dat zo is, moet deze stam ook 's nachts worden gekweekt. De donor stam en helper stam worden gekweekt met antibiotica om te selecteren op handhaving van het plasmide.
2. Subculture de donor, helper, en de ontvanger stammen in voe....

Discussion

De hier beschreven protocol verschaft een werkwijze voor de optische detectie van bacteriën in een nematode host (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de optische transparantie van nematoden en het vermogen om fluorescent label bacteriën, waardoor in vivo analyse van bacteriën in de nematode host (figuur 3). Bijzonder heeft deze benadering identificeert bacteriële lokalisatie in ontvanger. Door het tellen van een nematodenpopulatie en scores voor bacteriële aanwezigheid ka.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Lipid Agar (Steriel)			8 gram kweekbouillon, 15 gram agar, 5 g gistextract, 890 ml water, 10 ml 0,2 g / ml MgCl2. 6H 2 0, 96 ml glucosestroop oplossing *, 4 ml maïsolie * Roer media terwijl het gieten van platen * Voeg steriel stof na het autoclaveren
Corn Syrup Oplossing (Steriel)			7 ml glucosestroop, 89 ml water mix en autoclaaf
Egg Oplossing			16,6 ml 12% natriumhypochloriet, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (Steriel)			5 g gistextract, 10 g trypton, 5 gram zout, 1 L water mix en autoclaaf
Microfuge	Visser	13-100-675	Elke microfuge dat microfugebuizen houdt zal werken
Centrifugeer	Beckman	366802	Grote tafelcentrifuge dat 15 ml en 50 ml conische buizen houdt
Steriele 60 mm x 15 mm petrischaaltje	Visser	0875713
50 ml centrifugebuizen	Visser	05-539-6
15 ml centrifugebuizen	Visser	05-531-6
Steriel 100 mm X 20 mm petrischaaltje	Visser	0875711Z	Dieper dan de standaard petrischalen
24-well plaat	Greiner Bio-One	662.000-06
Microscoop			De microscoop moet tl-mogelijkheden compatibel is met uw fluorofoor
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (Steriel)			8 g NaCL 0,2 g KCL 1,44 g Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2PO 4 1 L water Pas de pH van 7,4 en water tot 1 liter autoclaaf en
Microfugebuizen	Visser	05-408-138	2 ml of 1,5 ml buisjes
Shaker			Elke shaker die ervoor zorgt dat de vloeistof zachtjes bewegen zal werken
Diaminopimelinezuur	Sigma	D-1377	Indien nodig, aanvulling medium tot een concentratie of 1 mM