$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Weinig natuurlijk voorkomende plasmiden worden gehandhaafd in zoogdiercellen. Onder deze zijn genomen van gamma-herpesvirussen, zoals Epstein-Barr virus (EBV) en Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus (KSHV) die leiden tot meerdere menselijke maligniteiten 1-3. Deze twee genomen worden gerepliceerd in een erkende wijze elk een unieke virale eiwitten en cellulaire replicatie machines, en worden doorgegeven aan dochtercellen bij celdeling ondanks hun waar traditionele centromeren 4-8.
Er is veel werk gedaan om de replicatie van deze plasmide genomen karakteriseren methoden zoals Southern blotting en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Deze methoden zijn beperkt, alhoewel. Kwantitatieve PCR en Southern blots informatie over het gemiddelde aantal plasmiden per cel in een populatie van cellen. FISH is een single-cell assay dat zowel het gemiddelde aantal en de verdeling van plasmide onthult s per cel in de populatie van cellen, maar statisch, zodat geen informatie over de ouder of nakomelingen van de onderzochte cel.
We beschrijven een werkwijze voor het visualiseren van plasmiden in levende cellen. Deze methode is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lactose repressor eiwit naar meerdere locaties in het plasmide plaats 9. Het DNA van belang is ontworpen om ongeveer 250 tandem repeats van de lactose operator (LACO) sequentie omvatten. LACO is specifiek gebonden door de lactose repressor eiwit (LacI), die kan worden gefuseerd aan een fluorescerend eiwit. Het fusie-eiwit kan tot expressie worden gebracht van de kunstmatige plasmide zijn of van een retrovirale vector. Op deze wijze worden de DNA moleculen fluorescent gelabeld en daardoor zichtbaar via fluorescentiemicroscopie. Het fusie-eiwit wordt geblokkeerd binden van plasmide DNA door het kweken van cellen in aanwezigheid van IPTG tot de plasmiden kan worden bekeken. NHOUD "> dit systeem kan de plasmiden worden bewaakt in levende cellen heen zijn de eigenschappen onthullen hun synthese en partitionering dochtercellen. Ideal hechtende cellen, getransfecteerd eenvoudig en hebben grote kernen. Deze techniek is gebruikt om te bepalen of 84% van EBV afgeleide plasmiden worden gesynthetiseerd elke generatie en 88% van de nieuw gesynthetiseerde plasmiden partitie getrouw aan dochtercellen in HeLa cellen. paren van deze EBV plasmiden werden gezien worden gebonden aan of verbonden met zusterchromatiden na hun synthese in S- fase totdat ze werden beschouwd te scheiden als zusterchromatiden gescheiden Anaphase 10. methode wordt momenteel gebruikt om replicatie van KSHV genomen in HeLa cellen en SLK cellen te bestuderen. HeLa cellen geïmmortaliseerde menselijke epitheelcellen en SLK cellen geïmmortaliseerde humane endotheliale cellen. Hoewel SLK-cellen werden oorspronkelijk afkomstig van een KSHV laesie, noch de HeLa noch SLK cellijn natuurlijk harbors KSHV genomen 11. Naast het bestuderen van virale replicatie kan deze visualisatie techniek worden toegepast om de effecten van de toevoeging, verwijdering of wijziging van verschillende DNA sequentie-elementen op synthese, lokalisatie en partitioneren van andere recombinant plasmide DNA te onderzoeken.