Gelijktijdig Intracellulaire opnemen van een lumbale motoneuron en de kracht die door de motor in de volwassen muis<em&gt; In vivo</em

Samenvatting

Deze nieuwe methode maakt het gelijktijdig intracellulaire opname van een volwassen muis motoneuron en de meting van de kracht die door de spiervezels. De gecombineerde onderzoek van de elektrische en mechanische eigenschappen van motoreenheden in normale en genetisch gemodificeerde dieren is een doorbraak voor de studie van het neuromusculaire systeem.

Samenvatting

De spinale motoneuron al lang goed model voor het bestuderen neurale functie omdat het een neuron van het centrale zenuwstelsel met de voordelen van (1) met omlijnd targets (spiervezels) en dus met een zeer bekende functie (spier contractie beheersen); (2) is de convergente doelwit van vele spinale en dalend netwerken, vandaar de naam "uiteindelijke gewone weg", en (3) met een grote soma die het mogelijk maakt om te penetreren met scherpe elektroden intracellulaire . Bovendien, als in vivo, is het mogelijk tegelijkertijd de elektrische activiteit van de motoneuronen en de kracht die door de spier targets. Uitvoeren intracellulaire opnamen van motorneuronen in vivo daarom het experimentator in de unieke positie te kunnen bestuderen, tegelijkertijd, alle compartimenten van de "aandrijving" (de naam van de motoneuron, het axon ende spiervezels het innerveert ^1): de ingangen afbreuk te doen aan de motoneuron, de elektrofysiologische eigenschappen van het motoneuron, en de impact van deze eigenschappen op de fysiologische functie van de motoneuronen, dwz de kracht die door de motor. Deze benadering is uitdagend omdat de bereiding niet kan verlamd en daarmee de mechanische stabiliteit voor de intracellulaire opname verminderd. Zo heeft dit soort experimenten alleen bereikt bij katten en ratten. Anderzijds kan de studie van spinale motorische systemen maken een enorme sprong of het mogelijk was om dergelijke experimenten in normale en genetisch gemodificeerde muizen.

Om technische redenen is de studie van de spinale netwerken in muizen meestal is beperkt tot neonatale in vitro preparaten die de motoneuronen en het ruggenmerg netwerken zijn onvolwassen, zijn de motoneuronen gescheiden van hun doelen, en toen studeerde in plakjes, de motoneurons gescheiden van het grootste deel van hun ingangen. Tot voor kort had maar een paar groepen in geslaagd om intracellulaire opnames van motoneuronen te voeren in vivo ^2-4, met inbegrip van ons team die publiceerde een nieuw preparaat die ons toeliet om zeer stabiele opnamen van motoneuronen te verkrijgen in vivo bij volwassen muizen ^5,6. Echter, deze opnamen verkregen in verlamde dieren, dus zonder de mogelijkheid om de kracht output van deze motoneuronen nemen. Hier geven we een uitbreiding van deze oorspronkelijke preparaat waarin we konden gelijktijdige opnamen van de elektrofysiologische eigenschappen van de motoneuronen en de kracht die door de aandrijving te verkrijgen. Dit is een belangrijk resultaat, omdat het ons in staat stelt om de verschillende types van motoneuronen te identificeren op basis van hun kracht profiel, en daardoor onthullen hun functie. In combinatie met genetische modellen te storen spinale segmentale circuits ^7-9, of reproducting menselijke disease ^10,11, verwachten we dat deze techniek een essentieel instrument voor de studie van spinale motorische systeem.

Protocol

1. Stap een

Preanesthetisch medicatie: 10-15 min vóór de inductie van de anesthesie, injecteren atropine (0,20 mg / kg) en methylprenidsolone (0,05 mg) subcutaan te kwijlen en oedeem respectievelijk voorkomen.

2. Stap twee

Inductie van anesthesie: injecteren pentobarbitalnatrium (70 mg / kg) of een mengsel van ketamine / xylazine (100 mg / kg en 10 mg / kg) intra-peritoneaal. Laat de muis gaan onder tot er geen teen knijpen reflex kan worden verkregen. Als de verdoving lijkt te licht, aangevuld met 1/4 van de dosis.

3. Stap drie

* Opmerking: deze operatie is een terminal procedure.

Wanneer een chirurgische vlak van anesthesie is bereikt, brengt de muis op een verhoogde deken in een liggende positie.

1. Bedek de snuit van de muis met een masker voor zuiver O _{2 met} een stroomsnelheid ongeveer 100 ml / min.
2. een tondeuse gebruiken, scheer het dorsale gebied van de nek van de nek tot de basis van de staart.
3. Scheer ook het recht achterbeen.
4. Flip de muis om rugligging maar zorg om het zuurstofmasker te laten zitten.

4. Stap vier

Zet de muis op zijn plaats met hechtingen een lus rond de ledematen en vastgezet op de vier hoeken van het werkblad.

5. Stap vijf

Plaats een temperatuursensor om de muis kerntemperatuur controleren. Pas verwarming deken / lampvermogen tot een kerntemperatuur te behouden tussen 36 ° C en 38 ° C.

6. Tracheotomie en kunstmatige beademing

1. Met behulp van botte schaar, maken een snee boven de luchtpijp en weg te trekken van de huid aan beide zijden.
2. Met behulp van stompe tang, verscheuren de speekselklier om twee dunne spieren (Sternohyoid) met betrekking tot de luchtpijp bloot te leggen.
3. Met behulp van stompe tang, haal de twee muscles langs hun mediale scheiding tot de trachea onthullen.
4. Met behulp van een Dumont 7 pincet, schuift u twee lengte van 4,0 zijden hechtdraad onder de luchtpijp.
5. Maak een dwarse doorsnede in de luchtpijp tussen twee kraakbeen ringen, maar let op dat volledig deel van de luchtpijp.
6. Plaats de tracheale tube de luchtpijp, zet deze dan vast aan beide zijden van de insteekopening door koppelverkoop de hechtingen over. De tracheale buis is verbonden met een muis ventilator (SAR-830/AP, CWE Inc) en een capnograaf (μcapstar, CWE Inc.) De ventilator is aangesloten, via een naleving zak met een bron van zuivere O _2. Pas de parameters van de ventilator (ademhaling 100 tot 150 slagen per minuut, end-tidal volume 170 tot 310 pi), zodat de muis niet is vechten tegen de kunstmatige beademing en het end-tidal pCO ₂ is ongeveer tussen de 4 en 5%.

7. Plaatsing van de intraveneuze lijnen

1. Met behulp van stompe dissectie technieken bloot jugularisader aan een zijde van de hals. Op dit niveau, de halsader splitst in twee grote koffers, de voorste en achterste gezicht aderen.
2. Voer de volgende stappen twee keer, een voor elk van deze stammen:
   1. Met behulp van Dumont 4 of 5 tangen, Haal voorzichtig de ader van de omringende bindweefsel.
   2. Met behulp van Dumont 7 tang, schuift u twee lengte van 6,0 zijden hechtdraden onder de ader. scheid ze zoveel mogelijk over de lengte van de ader.
   3. Plaats een klein schip clip aan de proximale zijde van de ader (de zijde het dichtst bij het hart), en afhechten de distale zijde van de ader.
   4. Met behulp van zeer fijne iris schaar, een kleine dwarse incisie in de ader, waarbij grote zorg niet te vinden in hoofdstuk de ader volledig.
   5. Plaats een voorgevulde 1FR catheter (premicath, Vygon) in de opening tot het schip clip.
   6. Houd de ader en de katheter samen in een Dumont 4 tang, verwijder voorzichtig het schip clip en druk de katheter een paar more millimeter in de ader.
   7. Zet de catheter door dit te koppelen met beide hechtingen aan beide zijden van de insertie.
3. Een van de katheters is verbonden met een injectiespuit of een injectiepomp van aanvullende doses anesthetica indien nodig (veelal 10-30 min). Injecteren De IV dosis hetzij 6 mg / kg natriumpentobarbital of 1250 +40 ug / kg / min van ketamine / xylazine ^12. De andere katheter is verbonden met een spuitpomp voor een langzame intraveneuze infusie (50 ul / uur) van een 4% glucose oplossing die _NaHCO3 (1%) en plasmion (14%).

8. Sluit het nekvel met naald en hechtdraad, en Zet de muis naar buikligging

9. Dissectie van de achterste ledematen spieren en zenuwen

1. Met behulp van een schaar, een insnijding van de bovenkant van de dij naar de achillespees. Scheid de huid van de onderliggende spieren, zorg ervoor dat u de bloedvaten beschadigen. Cauterize indien nodig.
2. Identificeer de voorste rand van de biceps femoris, die verschijnt als een witte lijn langs de dij. Met behulp van een schaar, open dan voorzichtig langs de lijn van de knie tot aan de heup bot. Scheid de spieren. De nervus ischiadicus is nu zichtbaar onder de biceps femoris.
3. Voorzichtig ontleden de biceps femoris. Cauterize / ligatuur als nodig is om bloedingen te voorkomen. De biceps femoris kan volledig worden verwijderd, of gewoon achterover van de nervus zenuw en de Triceps surae spieren bloot te leggen.
4. Prepareer de Sural zenuw.
5. Met behulp van 8/0 zijden draad, binden de distale deel van de gemeenschappelijke peroneus zenuw en snijd distaal van de knoop. Ontleden de zenuw helemaal, zo dicht mogelijk bij de heup mogelijk.
6. Identificeer de tibialis zenuw in tussen het gemeenschappelijk peroneus en Sural zenuwen. Van de verschillende takken van de nervus tibialis, identificeren van de takken innerveren de Triceps surae uit de takken die dieper (hierna te noemen tibiale zenuw).
7. Met 8/0 zijdedraad, binden samen alle takken van de nervus tibialis, terwijl intact houden van de takken innerveren de triceps surae. Distaal Snijd de de nervus tibialis om de knoop door en ontleden de zenuw zo ver mogelijk.
8. Het gehele achterpoot met een gaas doordrenkt met zoutoplossing om uitdroging te voorkomen en te gaan met de volgende stap.

10. Laminectomie

1. Met behulp van een schaar, een insnijding langs de ruggengraat. Scheid de huid van de onderliggende spieren.
2. Maak twee insnijdingen aan weerszijden van de wervels in het onderhuidse spieren scheiden. En snijd elke pees van de spieren die hechten aan de zijde van de wervels aan elke kant.
3. Met stompe en een fijne forceps curette, verwijder dan de rest van de spier aan de dorsale zijde van de wervels in de doornuitsteeksels om nauwkeurig elk individuele wervel.
4. Identificeer wervels T13 en L1. T13 is de laatste wervel te hebben ribben aangesloten. De wervelkolom wziek worden geïmmobiliseerd met behulp van de Cunningham Spinal Cord vertebrale klemmen (Stoelting Co). Plaats de spinale klemmen aan beide zijden van T13 en L1. Zorg ervoor dat u het ruggenmerg samendrukken, maar zet een beetje spanning in de lengte-as. Controleer of de wervelkolom goed is beveiligd door naar beneden te drukken voorzichtig met een pincet.
5. Met behulp van fijne rongeurs, verwijder de ruggengraat processen de laminae op T13 en L1, waardoor nog het ruggenmerg.
6. Bedek de blootgestelde ruggenmerg met kleine stukjes van katoen of spongel ingezogen met een zoutoplossing om uitdroging te voorkomen.
7. Plaats een op maat gemaakte kunststof bad op de top van de rug, rond het ruggenmerg. Zet het bad op zijn plaats met 4/0 zijden draad. Zorg ervoor dat het bad is waterdicht door afdichting met Kwik-Cast afdichtmiddel (WPI).
8. Zodra de Kwik-Cast is opgedroogd, verwijdert u de katoen die het ruggenmerg, en vul het bad met minerale olie.
9. Met behulp van Dumont 5 tangen en zeer fijn iris schaar, trek voorzichtig aan de dura mater rond het ruggenmerg, en open het zo ver mogelijk in beide richtingen. Vouw de dura aan weerszijden van het ruggenmerg.
10. Laat de verhoogde platform waarop de muis als zodanig ligt te houden opgehangen aan de vertebrale klem.
11. Gebruik een andere klem aan een wervel processus spinosus van het sacrale gebied aan de achterkant van het dier Draagklemsystemen.
12. Een derde klem wordt gebruikt om de juiste achterpoot en enkel immobiliseren, gebogen in een hoek van 90 ° op de knie.

11. Achillespees Dissection

1. Met de ledematen gebogen op 90 ° bij de knie en op de enkel, verwijder het gaas voor de achterpoot gebied, en ontleden de achillespees vrij van de omgevende weefsels. Ontleden zoveel mogelijk Triceps surae van omringend weefsel ook.
2. Snijd de pees van de Plantaris spier in de buurt van de calcaneus, dan weer knippen om de pees volledig te verwijderen.
3. Met behulp van een schroefdraad naald, bevestig 6/0 zijden draad door ee achillespees en maak een drievoudige knoop rond de pees.
4. Plaats de krachtopnemer in de buurt van de knoop, knip het distale deel van de pees, en bevestig deze aan de krachtopnemer met behulp van de zijden draad.
5. Plaats twee lengten van roestvrij staaldraad in de fascia van de triceps surae spieren. Deze draden zijn verbonden met een extracellulair AC versterker voor EMG opname.
6. Plaats de gemeenschappelijke peroneus zenuw en de nervus tibialis op twee bipolaire haak elektroden.
7. Plaats de Triceps surae zenuw aan de kathode van een haak elektrode, de anode raken een nabijgelegen spier.
8. Sluit alle stimulatie-elektroden een isolatie-eenheid.
9. Plaats een bal elektrode op het dorsale oppervlak van het ruggenmerg, aangesloten op een extracellulair AC versterker koord dorsum potentialen nemen. Plaats een Ag / AgCl referentie-elektrode in contact met de rugspieren.

12. Stap Twaalf

Stimuleren van de triceps surae zenuwmet een 50 vierkante psec puls van toenemende intensiteit bij een lage frequentie (<1 Hz) tot maximum twitch amplitude wordt waargenomen. Verplaats de krachtopnemer de spier rekken tijdens het bewaken van de amplitude van de spierrespons tot twitch amplitude maximaal is.

13. Intracellulaire Opnames van motorneuronen

Vanaf dit punt worden standaard elektrofysiologische technieken gebruikt om een ​​intracellulaire elektrode bereiden, een neuron dringen in het ruggenmerg en het identificeren als een motoneuron.

1. Trek een glas micropipet om een ​​~ 1 micrometer spuitkop en een pipet trekker (P-97 Micropipet Puller, Sutter Instruments). Vul de elektrode met een 3M oplossing KCl (weerstand van de elektrode 10-20 MQ).
2. Met een micropositioner, rijdt de micropipet aangesloten op een intracellulaire versterker (Axoclamp 2B, Axon Instruments) in het ruggenmerg. Controleer de locale veldpotentialen opgewekt door de stimulatie van each zenuw naar de motor pool van de triceps surae vinden.
3. Voorzichtig benaderen vermeende motoneuronen, terwijl het toezicht op de weerstand van de micro-elektrode. Wanneer duwen tegen een membraan, de weerstand verhoogt. Penetratie kan soms worden vergemakkelijkt door gebruik te maken van de "buzz"-functie van de intracellulaire versterker.

14. Euthanasie Procedure

Aan het eind van het experiment wordt het dier gedood door een overdosis pentobarbital (210 mg / kg IV), waarna zij werden onthoofd.

Resultaten

Figuur 1 toont hoe het identificeren van een motoneuron de Triceps surae groep na penetratie. Bij lage intensiteit van de stimulatie kan slechts een monosynaptic EPSP worden waargenomen (Figuur 1A). Bij hogere intensiteit kan de EPSP zijn groot genoeg om een "orthodromic" spike (Figuur 1B) activeren. Nog hogere stimulatie-intensiteit, een alles-of-niets antidromic spike weergegeven met een kortere vertraging dan monosynaptic EPSP (Figuur 1C). ...

Discussie

De bereiding hier beschreven is het eerste dat toelaat in de volwassen muis, gelijktijdig intracellulaire opname van een lumbale motoneuron en de meting van de kracht die door de spiervezels geïnnerveerd door de axon.

Door de kleine grootte van het dier, kan de chirurgische vaardigheden voor dit preparaat tegen te verwerven. Echter, zodra de vaardigheden meester is, kan de hele operatie worden uitgevoerd in drie uur en de dieren overleven tot 7 uur na de afloop van de chirurgische procedure ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Atropinesulfaat	AGUETTANT
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Natrium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Stompe schaar	FST	14.079-10
Blunt fijne schaar	FST	15.025-10
Vannas Spring Schaar	FST	15.002-08
Fijne tang getande	FST	11.370-32
Fijne tang getande	FST	11.370-31
Cunningham Spinal Adapter	Stoelting Co
Kwik-Cast kit	WPI	# KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograaf	CWE Inc	μcapstar
Verwarming deken	Harvard Apparatus	507221F
Intracellulaire versterker	Axon Instrumegen	Axoclamp 2B
Pipetteer trekker	Sutter Instrumenten	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G