Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Samenvatting

Een procedure beschreven voor het manipuleren van de activiteit van cerebrale corticale piramidale neuronen optogenetically terwijl de elektro, elektromyogram en cerebrale lactaatconcentratie bewaakt. Experimentele opnamen worden uitgevoerd op kabel-tethered muizen, terwijl ze ondergaan spontane slaap / waak cyclus. Optogenetic apparatuur geassembleerd in ons laboratorium controleapparaat handel verkrijgbaar.

Samenvatting

Hoewel de hersenen minder dan 5% van het lichaam massa, gebruikt het ongeveer een kwart van de glucose door het lichaam in rust ^1. De functie van niet rapid eye movement slaap (NREMS), het grootste deel van de slaap door de tijd, is onzeker. Echter een opvallend kenmerk van NREMS een significant verlaagd van cerebrale glucosegebruik opzichte van waakzaamheid ^2-4. Deze en andere bevindingen hebben geleid tot de wijdverbreide opvatting dat de slaap een functie met betrekking tot cerebrale metabolisme dient. Toch is de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vermindering van de cerebrale glucosemetabolisme tijdens NREMS nog worden opgehelderd.

Een fenomeen dat geassocieerd met NREMS cerebrale metabolisme kan beïnvloeden is de aanwezigheid van trage golven, trillingen bij frequenties lager dan 4 Hz, in het elektro ^5,6. Deze trage golven waargenomen op het niveau van de schedel of cerebrale corticale oppervlak weerspiegelen deoscillaties van de onderliggende neuronen tussen een gedepolariseerde / omhoog staat en een gehyperpolariseerde / down toestand ^7. Tijdens de beneden staat, moet cellen ondergaan actiepotentialen voor intervallen van maximaal enkele honderden milliseconden. Herstel van ionische concentratie gradiënten na actiepotentialen is een belangrijke metabole belasting van de cel ^8; afwezigheid van actiepotentialen tijdens beneden die geassocieerd worden met NREMS kunnen bijdragen tot een vermindering van de stofwisseling ten opzichte van wakker.

Twee technische uitdagingen moest worden aangepakt om voor deze hypothetische relatie te testen. Eerste moest cerebrale glycolytisch metabolisme meten met een tijdsresolutie afspiegeling is van de dynamiek van de cerebrale EEG (dat wil zeggen over seconden in plaats van minuten). Hiertoe maten we de concentratie van lactaat, het product van aerobe glycolyse en derhalve een indicatie van de snelheid van glucosemetabolisme in de hersenen van muizen. Lactaat isgemeten met een lactaatoxidase gebaseerde real time sensor ingebed in de frontale cortex. De detectie mechanisme bestaat uit een platina-iridium elektrode omgeven door een laag van lactaatoxidase moleculen. Metabolisme van lactaat door lactaatoxidase produceert waterstofperoxide, die een stroom produceert in de platina-iridium elektrode. Dus een intensifiëring van cerebrale glycolyse wordt een toename in de concentratie van substraat voor lactaatoxidase, die vervolgens in verhoogde stroom gereflecteerd onder meetelektrode. Het was bovendien noodzakelijk om deze variabelen te meten tijdens het manipuleren van de prikkelbaarheid van de cerebrale cortex, om deze variabele isoleren van andere facetten van NREMS.

We bedachten een experimenteel systeem voor gelijktijdige meting van neuronale activiteit via de elecetroencephalogram, meting van de glycolytische flux via een lactaat biosensor, en manipulatie van cerebrale corticale neuronale activiteit via optogenetic activering van PyraMIDAL neuronen. We hebben dit systeem gebruikt om de relatie tussen slaapgerelateerde elektro golfvormen en het moment tot moment dynamiek van lactaatconcentratie in de cerebrale cortex documenteren. Het protocol kan nuttig zijn voor elk individu geïnteresseerd in het bestuderen in vrij gedragen knaagdieren, de relatie tussen neuronale activiteit gemeten op de elektro-niveau en cellulaire energetica in de hersenen.

Protocol

1. Chirurgische Voorbereiding van de dieren

1. Experimentele Onderwerpen

Gebruik van de muizen B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgene lijn ^9; JAX stam # 7612) of muizen die het blauwe lichtgevoelige kationenkanaal, Channelrhodopsin-2, in cerebrale corticale neuronen. Toepassing van blauw licht naar de cerebrale cortex van de B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgene lijn zorgt ervoor dat de piramidale neuronen die Channelrhodopsin-2 te depolariseren en actie ondergaan potentialen ^9,10. Als gevolg van piramidale celactivering, lokale interneuronen geactiveerd en de potentiaalverandering wordt verspreid naar neuronen dan de plaats van stimulatie ^10. Voer een operatie onder steriele omstandigheden in de naleving van toepasselijke wettelijke bepalingen: autoclaaf chirurgische instrumenten en softpacks (chirurgische veld, gaasjes); hete kraal steriliseer alle warmte-tolerante geïmplanteerde metalen apparaten (canules, schroeven en draden)voor 30-seconden; Desinfecteer warmte-intolerantie implanteerbare apparaten (glasvezelkabel, plastic connector) met een 10-sec dompelen in ethanol; klap ethanol-ondergedompelde artikelen droog door toepassing van perslucht.

2. Anesthesie, stereotaxische plaatsing en de goedkeuring van de Schedel

Gebruik de IMPAC ⁶ Geïntegreerde Multi Patient (Vet Equip Inc) systeem om de muis te verdoven. Gebruik 5% Isoflurane/95% zuurstof voor inductie en 3% Isoflurane/97% zuurstof voor onderhoud tijdens de operatie. Plaats het dier op een circulerend water-deken op 37 C. Het is niet nodig om lichaamstemperatuur te controleren als de deken op deze temperatuur gehouden.

3. Voorbereiden van de Schedel voor Implantatie

Bereid de incisie door scheren alle bont vanaf de top van de schedel. De geschoren gebied moet lateraal uitstrekken van oor tot oor en anterior-posterior van de ogen naar het achterste einde van de schedel. Desinfecteer de blootgestelde huid met drie ACHTEREENVe swabs van betadine gevolgd door ethanol. Een mediale incisie op de bovenkant van de schedel, vanuit de ogen naar de achterkant van de schedel. Reinig de schedel met waterstofperoxide en steriele zoutoplossing (0,9% NaCl). De controle bloeden met een cauterizing tool. Zoek en bregma en lambda markeren voor het bepalen van stereotaxische coördinaten. Stereotactische coördinaten van elektrode / optogenetic stimulus configuraties die we hebben gebruikt worden in tabel 1 en schematisch weergegeven in figuur 1A.

4. Voorbereiding van de implantatie-sites op Skull

Gebruik een hoge snelheid tandheelkundige boor met een 0,5 mm bal braam beetje op elke plaats van implantatie in de schedel vast te stellen. Schuin de externe marge van elke hole met behulp van een 0,7 mm kogel braam beetje aan schroef inbrengen te vergemakkelijken.

5. Inbrengen en vastzetten van canules, EMG Leads en EEG Leads

Plaats EEG schroeven (0,8 lengte van 2 cm van onbehandelde 30-gauge vertind-koperen bus wire pre-gesoldeerd aan het hoofd schroef) in de gaten en ze rijden in met een schuimspaan uit de hand schroevendraaier ongeveer 4-5 omwentelingen op de gewenste diepte te verkrijgen. Houd gids canules op zijn plaats met een stereotaxische canule houder en vervolgens brengen ze naar de schedel en ankers met acryl cement. Elke geleidingscanule moet een dummy canule / stylet (Plastics, onderdeel # C312 DC \ 1) vanaf het moment van operatie om de tijd van het experiment (10-14 dagen) de doorgankelijkheid te handhaven.

6. Het sluiten van Chirurgische Site

Zodra EEG's en gids canules zijn geplaatst in de schedel, ze band samen met tandheelkundige acryl cement (Lang Dental - Ortho-Jet cement). Na cement sets, plaatst u de plastic connector (Pinnacle Technology onderdeel # 8402) boven het gedroogde cement heuvel. Soldeer de einden van de draden afkomstig van EEG leidt tot contacten op de plastic connector. Encase de draden in cement. Teken dan de EMG draden door de nuchal spiers door te schuiven ze in de loop van een 21ga naald doorboord spier. Maak een dubbele chirurg knoop van 5-0 nylon hechtdraad rond deze draden net distaal van waar het snoer de spier. Weer bij elkaar hechten van de huid die is ingetrokken bij het spierweefsel met een enkele onderbroken chirurg knopen te openen, met behulp van een omgekeerde snijden P-3 naald en 5-0 nylon hechtdraad.

7. Postoperatieve analgesie en herstel

Dien buprenorfine als pijnstiller (0,1 mg / kg, subcutaan) en flunixine meglumine (0,1 mg / kg, subcutaan) als anti-inflammatoire onmiddellijk na de operatie en dagelijks op dagen 1-2 na de operatie. Toestaan ​​dat dieren in standaard kolonie huisvesting te herstellen gedurende ten minste zeven dagen voor de experimenten. Zonder extra zorg buiten standaard kolonie behuizing, kan canules worden verwacht dat octrooi blijven gedurende ten minste twee weken met de inwonende stiletten vastgezet. EEG en EMG sensoren kunnen worden verwacht behoudenfunctionaliteit voor deze duur.

2. Generatie van Timed lichtpulsen

1. Programmering van MC Stimulus Unit

Sluit de MC-Stimulus-eenheid (Multi-Channel Systems) via een USB-verbinding met een desktop computer. Gebruik de spreadsheet-achtige MC-Stimulus gebruikersinterface om de MC Stimulus unit te programmeren. De gewenste TTL (transistor-transistor logic) spanning voor de aan periode, de duur van stimulus en uitschakelen perioden, het aantal cycli per seconde gewenst en het aantal herhaalde cycli voor de volledige stimulus sessie. Voor verdere details zie MC-Stimulus technische handleiding:

3. Fabricage / Montage van Fiber Optic Pruittredingen voor Light Delivery naar de cerebrale cortex

1. Supplies en apparatuur die nodig zijn te vinden op: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
2. Slijpen en polijsten van glasvezelkabels. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Montage van knaagdieren Optogenetic Stimulatie System

1. Interface van MC-Stimulus Unit en Laser

Zodra de MC-Stimulus-eenheid is geprogrammeerd, voer het uit als een stand-alone signaalgenerator van een 5-volts binaire AAN / UIT-signaal. Sluit de MC-Stimulus toestel aan op de TTL ingeschakelde voeding van de laser met BNC connectoren.

2. De productie van Laser uitgang via optische kabel

Gebruik de digitale display en variabele vermogen wijzerplaat van de laser power unit op handmatigly passen het vermogen van de laser. Sluit de laser power unit van de laser via een lintkabel. Sluit de vrouwelijke FC (ferrule connector) vezel-adapter van de laser aan de mannelijke FC connector op de optische vezel kabel (een 3 m lengte, 200 micrometer diameter glas geleiding glasvezel ingekapseld in lichtreflecterende acrylaatpolymeer bekleding).

3. Het overbrengen van de Laser van de Animal: Rotary Commutator

Sluit de uit glasvezelkabel (3 m lengte) en de levering glasvezelkabel (45 cm lang) aan tegenovergestelde uiteinden van de optische roterende afdichting inkapselen twee collimatorlenzen (Dorische lenzen). De glasvezel afdichting dient als commutator: het dier beweegt over de kooi, de afdichting roteert voorkomen breuk van de glasvezelkabels. Gebruik plastic kabelbinders aan het aanbrengen van de collector op een metalen staan ​​boven de cilindervormige kooi waarin het dier is ondergebracht.

4. Bevestiging van levering Fiber OpticKabel naar Hoofd

Beperk de muis door met een hand de muis pin onder een cupped palm. Richt de kop tussen midden van de experimentator en wijsvinger. Verwijder de dummy canule uit de gids canule geplaatst voor de glasvezel canule. Schakel de gids canule van materiaal door middel van een steriele naald 25ga. Steek de glasvezelkabel met de hand en zet het aan de vezeloptische geleider canule met een schroefdraad schroefdop geborgen uit een dummy canule. De diepte van inbrengen van de glasvezelkabel in de hersenen door een hechting knoop gebonden aan de glasvezelkabel op een vaste afstand van het vaste uiteinde gesplitst. De gehele experimentele opstelling wordt getoond in figuur 1B.

5. Meting van de EEG-gedefinieerde Slaap-en lactaatconcentratie tijdens Optogenetic Stimulatie

1. Precalibration van de Lactaat Sensor

Pre-kalibratie van de sensor lactaat wordt uitgevoerd met een in vitrokit (Pinnacle Technology onderdeel # 7000-K1-T). De sensor is geëquilibreerd in fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4), vervolgens blootgesteld aan drie concentraties van L-lactaat in stapsgewijs per fabrikant protocollen.

2. Het inbrengen van de Lactaat sensor en EEG-kabel

Plaats de vooraf gekalibreerde sensor in de schedel gemonteerd lactaat gids canule op een manier die identiek is aan de glasvezelkabel inbrengen procedure (paragraaf 4.4). Sluit de lactaat-sensor om de voorversterker van de Pinnacle 8.400 biosensor met een bipolaire connectoren. Bevestig deze voorversterker aan op de 8-polige connector op de chirurgisch geïmplanteerde headmount.

3. Tot oprichting van Optogenetic stimulusintensiteit

Voor het verzamelen van gegevens, gebruik maken van de laser intensiteit bedieningsknop naar de intensiteit van de optogenetic stimulus aan te passen. De amplitude van de respons EEG verschillen van dieren door factoren die niet systematisch onderzocht, een d worden gecontroleerd door visuele inspectie aan het begin van stimulatie. In de praktijk zal een intensiteit van 80-120 μWatts Kenmerkend voor een toename EEG amplitude van ongeveer 50% op de frequentie van de stimulatie. Post-hoc fast Fourier transform analyse (zie paragraaf 5.5) nodig om de absolute grootte van de respons kwantificeren.

4. Data Collection

Verzamel gegevens met behulp van de Pinnacle 8400 systeem: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Data Processing met Neuroscore

Classificeren slapen staten door visuele inspectie van de EEG en EMG data met de Neuroscore interface (DataSciences, Internationaal: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) of de Sirenia interface (Pinnacle Technologie:f = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Verwerken in tien seconden tijdperken als kielzog, niet-rapid eye movement slaap, of rapid eye movement slaap op basis van EEG en EMG. Gegevens opslaan als Microsoft Excel-spreadsheets voor verdere analyse en statistische testen.

Resultaten

Zoals getoond in figuur 2, een muis uitgerust voor optogenetic stimulatie en lactaat / EEG / EMG verzamelen van gegevens onderging spontane slaap / waak-overgangen tijdens het EEG, EMG en cerebrale lactaat concentratie werden continu bewaakt. Stroom bij de lactaat-sensor verhoogd tijdens periodes van lage amplitude EEG en nam af tijdens perioden van hoge amplitude EEG. Zoals getoond in figuur 3, beide kanalen van de EEG reageren op stimuli optogenetic geleverd i...

Discussie

De werkwijzen die hier doen vrezen relatie tussen slaap en veranderingen in de hersenen concentratie van de glycolytische tussenproducten lactaat meten op een tijdschaal niet eerder mogelijk was. Dieren ondergaan spontane overgangen tussen kielzog, NREMS en REMS. Bovendien zijn we in staat om optogenetic stimuli toe te passen terwijl de dieren ondergaan deze overgangen. Verzameld tot op heden dat spontaan en geïnduceerde golven invloed op het uitlezen van een lactaatoxidase gebaseerde biosensor tonen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bestanddeel	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Basi Muis gids canule	Pinnacle Technology / Basi Inc	7032
Lactaat Biosensor	Pinnacle Technology	7004
Kop gemonteerde	Pinnacle Technology	8402
Sleep / Biosensor Opnamesysteem	Pinnacle Technology	8400-K1-SL	2 EEG-kanalen, 1 EMG kanaal, & 1 biosensor
Vastgebonden Muis in-vitro kalibratie-kit	Pinnacle Technology	7000-K1-T
Fiber Optic gids canule	Kunststoffen Een	C312G	21 Gauge gids canule
Dummy canule	Kunststoffen Een	C312DC	21 Gauge Dummy
Diamond Fiber Scribe	Thorlabs	S90W
Fiber Connector Crimp Tool	Thorlabs	CT042
Furcatie Tubing	Thorlabs	FT030	03,0 mm
	Thorlabs	T10S13	Max Dia. 0.012
Furcatie Tube Stripper	Thorlabs	FTS3
Bare Hard Bekleding Multimode Fiber	Thorlabs	BFL37-200	200 urn Core, 0,37 NA
Draad afsnijden / Kevlar schaar	Thorlabs	T865
Fiber Optic Epoxy	Thorlabs	F112
Fiber Stripper Tool	Thorlabs
Glas Polijsten Plate	Thorlabs	CTG913
Rubber Polijsten Pad	Thorlabs	NRS913
Eye Loupe	Thorlabs	JEL10
Kim Wipes	Thorlabs	KW32
Perslucht	Thorlabs	CA3
Polijsten Puck	Thorlabs	D50-xx
Fiber Inspectie scope	Thorlabs	CL-200
Polijsten Films	Thorlabs	LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
FC / PC connector einde	Thorlabs	30126G2-240	240 micrometer Bore, SS Huls
MC Stimulus Unit	Multi-Channel Systems	STG-4002
MC Stimulus Software	Multi-Channel Systems	MC-Stimulus V 2.1.5
Blauwe laser	CrystaLaser	CL473-050-0
Laser Voeding	CrystaLaser	CL2005
Fiber Optic Rotary Joint	Dorische Lenzen	FRJ-v4
			Tabel 2. Supplies en apparatuur.