Genoom-brede gendeleties in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Door High Throughput PCR

Xiuchun Ge; Ping Xu

doi:10.3791/4356

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genoom-brede gendeleties in

16.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4356

⸱

23 november 2012

Xiuchun Ge¹ , Ping Xu¹

¹The Philips Institute of Oral and Craniofacial Molecular Biology, Virginia Commonwealth University

In dit artikel

Samenvatting

Een efficiënte genoom-brede enkel gen mutatie methode is vastgesteld aan de hand Streptococcus sanguinis Als modelorganisme. Deze methode heeft bereikt via high throughput recombinant PCRs en transformaties.

Samenvatting

Transposon mutagenese en single-gendeletie zijn twee methoden toegepast genoom knockout in bacteriën ^1,2. Hoewel transposon mutagenese is minder tijdrovend, minder duur en vereist geen voltooid genoominformatie zijn er twee zwakke punten in deze werkwijze: (1) de mogelijkheid van een heterogene mutanten in de gemengde mutant bibliotheek die tegen de mutanten geselecteerd met verminderde concurrentie; en (2) de mogelijkheid van gedeeltelijke geninactivering waarbij genen niet geheel verliezen hun functie na het inbrengen van een transposon. Single-gendeletie analyse kan compenseren voor de nadelen van transposon mutagenese. Om de efficiëntie van genoom-brede enkele gendeletie te verbeteren, proberen we een high-throughput techniek voor genoom-wijde enkele gendeletie met Streptococcus sanguinis als een model organisme. Elk gen in S. deletieconstruct sanguinis genoom ontworpen om 1 omvat-Kb stroomopwaarts van het targetgen, de APHA-3-gen, dat codeert voor kanamycine resistentie-eiwit, en 1 kb stroomafwaarts van het targetgen. Drie sets van primers F1/R1, F2/R2 en F3/R3 respectievelijk zijn ontworpen en gesynthetiseerd in een 96-well plaat formaat voor PCR-amplificaties van deze drie componenten van elke deletieconstruct. Primers R1 en F3 bevatten 25-bp sequenties die complementair zijn aan gebieden van de APHA-3 gen einde hun 5'. Een grootschalige PCR amplificatie van de APHA-3 gen wordt eenmaal uitgevoerd voor het maken van alle enkel gen deletieconstructen. De promotor van APHA-3 gen aanvankelijk niet het potentiële effect van kanamycine polaire cassette minimaliseren. De gendeletie constructies te realiseren, worden high-throughput PCR amplificatie en zuivering uitgevoerd in een 96-well plaat formaat. Een lineaire recombinant PCR amplicon voor elk gen deletie wordt samengesteld door vier PCR-reacties met high-fidelity DNA polymerase. De initiële exponpreferentiële groeifase van S. sanguinis gekweekt in Todd Hewitt bouillon aangevuld met 2,5% geïnactiveerd paardenserum wordt de bekwaamheid verhogen voor de transformatie van PCR-recombinant constructen. Onder deze voorwaarde, tot 20% van S. sanguinis cellen kunnen worden getransformeerd met ~ 50 ng DNA. Op basis van deze benadering werden 2.048 mutanten met enkele gendeletie uiteindelijk verkregen uit de 2.270 genen in S. sanguinis met uitzondering van vier gen ORFs die volledig binnen andere ORFs in S. sanguinis SK36 en 218 potentiële essentiële genen. De techniek voor het maken gendeletie constructen high throughput en kan gemakkelijk in genoom gen deleties gebruiken voor transformeerbaar bacteriën.

Protocol

1. Primer ontwerp

Primers zijn ontworpen met behulp huis scripts gebaseerd op de S. sanguinis SK36 genoomsequentie. Drie sets van primers, F1/R1, F2/R2 en F3/R3 zijn ontworpen voor amplificatie van de 1-kb stroomopwaartse sequentie van het doelwitgen, de APHA-3 gen dat codeert voor kanamycine resistentie (Km ^r) eiwit ³ en de 1 -kb stroomafwaartse sequentie van het doelwitgen, respectievelijk (Figuur 1). Van deze primers wordt F1 en R3 ontworpen met ePrimer3 in de EMBOSS pakket van programma's ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) om flankerende gebieden amplificeren stroomopwaarts of stroomafwaarts van het doelwit gen. Genspecifieke primers, R1 en F3 zijn ontworpen op basis van de 5'-en 3'-sequenties van het doelwitgen. R1 en F3 primers bevatten 25 bp adaptersequenties einde hun 5'die complementair zijn aan de APHA-3gen. De smelttemperatuur van elke primer werd ontworpen om zo dicht mogelijk bij 60 ° C tot gebruik van een uniforme annealing temperatuur voor PCR reacties in 96-well formaat mogelijk.
F1, R1, F3 en R3 primers worden gesynthetiseerd in 96-well platen op basis van een gen order. Elke plaat bevat een type primers in hetzelfde gen order. Verdun de primers in 96-well plaat werken primer tot een eindconcentratie van 10 pM voor PCR amplificatie met een meerkanaalspipet.

2. High-throughput PCR Amplification and Purification

Om high-throughput versterken 1-kb stroomopwaarts of stroomafwaarts van de doelgroep S. sanguinis genen monteren een PCR cocktail mengsel op ijs in een 15 ml conische buis met 1640 pi ddH ₂ O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul van 10 mM dNTP mengsel werd 100 ul 50 mM _MgSO4, 100 pi 10 ng / ul S. sanguinis SK36 genomisch DNA en 10 pl Platinum Taq DNA polymerase high fidelity en overdracht 23 ul van het mengsel in elk putje op 96-well PCR-plaat met een meerkanaalspipet. Breng 1 pi van elke F1 en R1 (of F3 en R3) van 10 pM primer werkt platen aan de PCR plaat met meerkanaalspipet. Dicht de PCR amplificatie uitgevoerd plaat en bij 94 ° C gedurende 1 min, en 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 54 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 1,5 minuten.
Bereid 1% agarose gel die ethidiumbromide met 48 wells fitting meerkanaalspipet loading. Meng 4 pl PCR product met 1 pi 5xDNA loading buffer op 96-well plaat en plaats de monsters op agarose gel met een 10-pl meerkanaalspipet. Draaien elektroforese bij 135 V gedurende 30 minuten. Onderzoek de band op gel onder UVP documentatie en analyse systeem.
Zuiver de PCR producten van Purelink 96 PCR purification kit met centrifugatie volgens aanwijzingen van de fabrikant. Voor het elueren van DNA, voeg 40 ul steriel ddH ₂ O naar de bron van de bINDENDE plaat.
Willekeurig pick verschillende gezuiverd amplicons op de plaat om de DNA-concentraties met behulp van NanoDrop spectrofotometer te onderzoeken. Dient de concentratie van amplicons op plaat tot ~ 10 ng / ul.
Een plasmide dat ^Kmr cassette wordt gedigereerd met EcoRI als PCR sjabloon. Het gedigereerde plasmide wordt gezuiverd door QIAquick PCR purification kit en het lineaire plasmide DNA wordt aangepast aan de uiteindelijke DNA concentratie van 10 ng / ul. Monteer 25 pi mengsel ^Kmr cassette amplicon inbegrip 16,4 ul ddH ₂ O, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ui 10 mM dNTP mengsel, 1 pi 50 mM Mg SO _4, 1 pi 10 pM F2, 1 pi 10 pM R2, 1 gl lineair plasmide DNA en 0,1 pl Platinum Taq DNA polymerase high fidelity. Voer PCR amplificatie bij 94 ° C gedurende 1 min, en 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 1 minuut. Onderzoeken PCR product door gel elektroforese op 1% agarose. Poola bulk van de ^Kmr cassette amplicon van 10 afzonderlijke PCR gezuiverd door QIAquick PCR purification kit. Stel de amplicon concentratie 10 ng / ul.
Om de uiteindelijke lineaire recombinant PCR amplicon te verkrijgen, worden drie PCR amplicons met elkaar gecombineerd 1 pi (in nagenoeg gelijke molaire hoeveelheden) in een PCR plaat en de PCR sjabloon. Andere PCR-componenten bevat, met inbegrip 14,4 pl ddH ₂ O, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ui 10 mM dNTP mengsel, 1 pi 50 mM Mg SO _4, 1 pi 10 pM F1, 1 pi 10 pM R3, 0,1 ul Platinum Taq DNA-polymerase high fidelity. PCR amplificatie wordt uitgevoerd bij 94 ° C gedurende 2 min, 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 3,5 min, en tenslotte 68 ° C gedurende 4 minuten.
Onderzoeken PCR amplicons op agarosegel. Zuiveren en kwantificeren PCR amplicons zoals hierboven beschreven. Bevries de gerecombineerde PCR amplicons bij -20 ° C.

3. Combevoegde Cellen Voorbereiding

Todd Hewitt bouillon bereid, pH aangepast tot 7,6 met 10 N NaOH, verwarmd tot koken en daarna afgekoeld tot kamertemperatuur en gesteriliseerd met 0,22 urn polystyreen filter ^4. Voeg 300 ul hitte geïnactiveerd horse sera (eindconcentratie 2,5%) en 11,7 ml Todd Hewitt bouillon in 15-ml conische buis te maken TH + HS medium. Aliquot TH + HS medium in 2 ml en 10 ml in buizen.
Inoculeer 5 ul van voorraad S. sanguinis SK36 ingevroren bij -80 ° C in 2 ml TH + HS medium en incubeer overnacht cultuur met aftopping goed bij 37 ° C tezamen met pre-incubatie van 10 ml-TH + HS buis.
Na overnacht, Pipetteer 50 ul cultuur in 10 ml TH + HS en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 3 uur (overeenkomend met OD ₆₆₀ van 0,07 tot 0.08), onmiddellijk gebruikt voor transformatie.

4. Cel Transformatie en antibiotische selectie

Voeg 2 pl 70 ng S. sanguinis SK36 bevoegdetentie stimulerende peptide (CSP) en 2 ui lineaire recombinant PCR amplicon (~ 50 ng) naar Eppendorf buisjes op 96-well blok voorverwarmen ze bij 37 ° C. Breng 330 pl van 3 hr-bebroede SK36 cultuur in elke buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Vervang DNA met steriel ddH ₂ O als controle.
Plaats het blok op ijs en verdeeld 100 pi van elke transformatie op Brain Heart Infusion (BHI) agar plaat met 500 ug / ml kanamycine. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 d onder microaerobe omstandigheden.

5. Mutant Bevestiging en opslag

Voor elke mutant vervanging, willekeurig neem 2 afzonderlijke kolonies, de kolonie inoculeren in 5 ml BHI dat 500 ug / ml kanamycine en incubeer het inoculum microaerobically nacht bij 37 ° C. Cryopreserveren elke cultuur in 30% glycerol bij -80 ° C
Om te onderzoeken of de mutant met de verwachte genvervanging, kolonie PCR voor elke mutant met F1 en R3 voerenprimers in 96-well plaat PCR. Ongeveer 1-pi overnacht cultuur van individuele kolonie wordt gebruikt als DNA template in 25-ul PCR-amplificatiereactie. PCR wordt uitgevoerd bij 94 ° C gedurende 5 min, 35 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 3,5 min, en tenslotte 68 ° C gedurende 4 minuten.
Om precies te identificeren dubbele band mutanten of contaminant PCR amplicon, onderzoekt de PCR amplicon door elektroforese gedurende 4 uur op> 12 cm lang 2% agarose gel met ethidiumbromide kleuring. Onder deze agarosegelelektroforese conditie, werden alle amplicons met ≥ 100 bp verschil duidelijk. Bij bands gevolg van amplificatie van de ^Kmr cassette en het wild-type gen worden verwacht verschillen <100 bp, een interne T1 primer wordt gebruikt om te bepalen of een wild-type gen kan worden gedetecteerd door PCR.
Om bevestigen de verwijdering worden de amplicons gezuiverd door Purelink 96 PCR purification kit en de sequentie met de primer P1 diebindt aan de ^Kmr cassette. Uitsluitend juiste mutanten bevestigd door sequencing.