Methodenartikel

Isoleren Primaire Melanocyte-achtige cellen van de Muis van het Hart

10.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4357

⸱

29 september 2014

 ,  ,  , 
1Penn Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol, w e identificeerde een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie veroorzaakt in muizen.

Samenvatting

We identificeerden een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie triggers in muizen. Om de elektrische en biologische eigenschappen van cardiale melanocyten onderzoeken we een procedure om ze te isoleren van de muis hart dat we afgeleid van de producten ontworpen voor neonatale muizen hartspiercellen isoleren ontwikkeld. Om gezonder hart melanocyten geschikt voor uitgebreidere patch clamp of biochemische studies te verkrijgen, ontwikkelden we een verfijnde procedure voor het isoleren en plating cardiale melanocyten op basis van die oorspronkelijk ontworpen om de huid melanocyten isoleren. De verfijnde procedure wordt gedemonstreerd in deze review en produceert grotere aantallen gezonde melanocyten-achtige cellen die kunnen worden verzilverd als een zuivere populatie of met hartspiercellen.

Inleiding

We identificeerden recent een nieuwe cel populatie in het hart van muizen en mensen die melanine-synthese enzymen uiten en morfologisch lijken cutane melanocyten. We noemden 'cardiale melanocyten' deze cellen en vond ze aanwezig in anatomische locaties van waaruit atriumaritmie triggers vinden vaak hun oorsprong in de mens zijn. We vonden ook cardiale melanocyten bijdragen aan atriale ritmestoornissen bij muizen met kiembaan verwijdering van Dct. Cardiale melanocyten dun verspreid muis atrium waar ze bevatten minder dan 0,1% van alle atriale cellen. Om de elektrische en biologische eigenschappen van cardiale melanocyten onderzoeken we een procedure te isoleren van het muizenhart met Cre-induceerbare melanocyt-specifieke merkers ontwikkeld. Onze eerste procedure werd ontwikkeld van die welke voor neonatale muizen hartspiercellen en leverde zeer kleine aantallen cellen die geschikt zijn voor patch clamp opnamen of PCR-analyse te isoleren. Echter, aan het verbeteren van het genezenste en de levensvatbaarheid van cardiale melanocyten, voor meer diepgaande elektrofysiologische analyse of biochemische studies, we een verfijnde procedure uit die bedoeld zijn om de huid melanocyten isoleren ontwikkeld. De beschreven en gedemonstreerd, beoordeling procedure heeft het voordeel van het produceren gezondere cardiale melanocyten die kunnen worden uitgeplaat als een zuivere populatie of cardiomyocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 Voorbereiden van de nodige oplossingen en apparatuur

  1. Eerst steriliseren de chirurgische instrumenten (rechte vorm tang, gebogen vorm tang, recht model scharen en scharen gebogen vorm) door ze te autoclaveren gedurende 15 minuten. bij 121 ° C. Bereid 2 sets van instrumenten, waarbij een set wordt gebruikt voor het ontleden van de harten en de andere set wordt gebruikt voor hakken het weefsel.
  2. Los 1 pakje MCDB153 voedingsbodems in 900 ml gesteriliseerd, gefilterd water en roer langzaam tot het poeder is opgelost. Voeg 1,2 g natriumbicarbonaat of 15.7 ml natriumwaterstofcarbonaat-oplossing [7,5% w / v], per liter eindvolume drager voorbereid en roer tot opgelost. Breng de pH op 7,2 door toevoeging van ofwel 1 N HCl of 1 N NaOH, en giet dan de media door een 0,2 micrometer fles top filter onder steriele omstandigheden in een weefselkweek kap (bioveiligheid kast). Verzamelen dan de media en het op 4 ° C.
  3. Bereid de aanvullingen opIn de kweekmedia (Materials List). De supplementen worden toegevoegd aan de media vlak voor het materiaal nodig voor het plateren van de cellen.
  4. Bereid DPBS met 10% FBS plus antibiotica (penicilline en streptomycine).
  5. Bereid vervolgens een 0,25% trypsine-oplossing door toevoeging van 0,25 g trypsine (bovine pancreas, activiteit> 2500 USP eenheden / mg, ultrapuur, USB) 100 ml van DPBS plus antibiotica (penicilline en streptomycine).
  6. Andere benodigde apparatuur die nodig is om deze procedure te voltooien onder een stereomicroscoop, Petri-schalen (10-cm), 50 ml conische buizen, 40-micrometer cel filters, DPBS plus antibiotica, 60-mm cultuur gerechten en 35-mm cultuur gerechten.

2 Isoleren van Harten van Neonatale Mouse Pups

  1. Eerst verkrijgen P0 P2 neonatale muis pups (n = 6 tot 8). Het wordt aanbevolen om pups die door het fokken Dct-Cre homozygote vrouwen met mannen die heterozygoot zijn voor ofwel de R26R zijn te gebruiken: EYFP allel of de Z / EG-allel op het etiketmelanocyt-achtige cellen. Beide R26R: EYFP en Z / EG muizen zijn verkrijgbaar bij Jackson Laboratories (voorraad nummers 006148 en 003920, respectievelijk).
  2. Vervolgens euthanaseren de neonatale muis pups, vegen hun borst met een alcoholdoekje en leg dan de pups in een 10-cm petrischaal met DPBS.
  3. Snijd de huid over de borst en het borstbeen met gesteriliseerde tang en schaar en open de borst voorzichtig onder een stereomicroscoop. De harten van de neonatale muis pups zijn erg klein dus wees voorzichtig om ervoor te zorgen om het hele hart te verwijderen met de atria verbonden.
  4. Was de harten in DPBS en overbrengen naar een nieuwe 10-cm petrischaal.

3 enzymatische afbraak

  1. Breng de Petri-schaal met de gesneden harten een weefselkweek kap (bioveiligheid kast) en volg dan de onderstaande behulp van steriele technieken in de kap stappen.
  2. Was eerst de harten drie keer in een steriele DPBS plus antibiotica.
  3. Plaats de harten (n = 6-8) in een60-mm kweekschaal en voeg 6-8 ml 0,5% trypsine oplossing van de schotel.
  4. Vervolgens stuurde de harten in kleine stukjes (minder dan 1 mm in grootte) en incubeer ze op 37 ° C gedurende 30 min in een 5% CO2 atmosfeer.
  5. Na de incubatietijd is voltooid, giet de verkregen oplossing van hartweefsel en trypsine van de schaal in een steriele 50 ml conische buis.
  6. Dan, met een 10 ml steriele pipet snel maar voorzichtig vermaal de oplossing in de 50 ml conische buis 30-50 keer.
  7. Filtreer de verkregen oplossing door een 40-um cel zeef op een nieuwe, schone 50 ml conische buis met het filtraat te verzamelen.
  8. Vervolgens centrifugeren de 50 ml buis bij 240 x g in een tafelmodel centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Dan, Zuig voorzichtig af en resuspendeer de resterende pellet in 6-8 ml steriele DPBS. Herhaal deze stap nog 2 keer. Deze stap pellets de atriale myocyten en cardiale melanocyten, maar niet omlaag brengen van de fibroblasts aangezien de fibroblasten kleiner en in de supernatant blijven.

4 Plating Cardiac Melanocyte-achtige cellen

  1. Wanneer driemaal spoelen na centrifugatie zorgvuldig afvoer of aspireren van de wasoplossing (DPBS) en resuspendeer de pellet in 6 ml MCDB kweekmedium waarin de supplementen toegevoegd.
  2. Nu, trek de geresuspendeerde oplossing in een steriele pipet overdracht en plaats de cellen in een 35-mm schaal, of in een putje van een 6-well plaat, en het zwembad de geïsoleerde cardiale cellen van 3 neonatale muizen in een 35-mm schaal of goed.
  3. Incubeer de schotels een nacht bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer, zuigen uit het kweekmedium samen met eventuele losse cellen en spoel de platen eenmaal met DPBS. Voeg dan vers medium aan de platen en de media vervangen elke 2 dagen. Cellen geïsoleerd uit neonatale of embryonale harten kunnen in cultuur worden gehouden voor maximaal 3 weken, terwijl cellen geïsoleerd uit volwassen horents kan in cultuur worden gehouden voor maximaal 10 dagen.

5. Isolating Cardiac Melanocyte-achtige cellen uit volwassen muis Hart

  1. Verwijder eerst de harten van volwassen muizen (3-4 weken oud, n = 3) via een middellijn sternotomie na toediening van heparine 100 U intraperitoneaal aan de muizen vervolgens euthanasie hen. Het wordt aanbevolen om pentobarbital te gebruiken om muizen te euthanaseren voor deze procedure, maar dit geneesmiddel is niet beschikbaar op alle locaties.
  2. Vervolgens was de weggesneden harten in steriele DPBS met antibiotica in een weefselkweek kap (bioveiligheid kast). Knijp de harten iets met gebogen ontleden tang om alle resterende bloed van ze te verwijderen en spoel dan de harten in DPBS nog een keer.
  3. Verwijder de atria en atrioventriculaire ring van de harten (deze structuren bevatten de melanocyten-achtige cellen) en plaats de weggesneden weefselmonsters in een 35 mm schaal.
  4. Snij de harten in kleine stukjes met behulp van gebogen schaar en krachtps en voeg 6-8 ml 0,5% trypsine oplossing van de schotel. Incubeer dan de gerechten bij 37 ° C gedurende 45-60 minuten.
  5. Nu, volg de stappen van de bovenstaande procedure vanaf stap 3.6 en later.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De in dit artikel beschreven protocol is een verbeterde techniek in vergelijking met degene die we eerder gepubliceerd voor het isoleren van cardiale melanocyten uit de muizen hart. Deze procedure maakt gebruik van het gebruik van fluorescente merkers gevolg van melanine synthese enzym-specifieke Cre-recombinase cardiale melanocyt-achtige cellen te labelen. Het is belangrijk om een marker cardiale melanocyten label bij het ​​werken met vers geïsoleerde embryonale of neonatale cellen, omdat de morfologische verschillen c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cardiale melanocyten aanwezig in anatomische locaties binnen het hart dat gewoonlijk tot atriale aritmie triggers geven. Deze gebieden omvatten de longaders, de atrioventriculaire annulus, het achterste linker atrium en het foramen ovale (figuur 4). Naar de rol die deze cellen spelen in aritmieën begrijpen, ontwikkelen we technieken om ze te isoleren en bestuderen hun fysiologie. Maar we erkend dat verbetering van deze techniek ter verkrijging gezonder en grotere hoeveelheden cardiale melanocyten zou to...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health award R01 HL105734 om VVPMDL wordt ondersteund, voor een deel, door de National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP is een innovatieve Onderzoeker van de American Heart Association ondersteund door subsidie ​​11IRG900384.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MCDB 153Sigma-AldrichM7403Oplossen in water
DPBS, zonder calcium zonder magnesiumInvitrogen14190136Voorraadconc.: 1x
Werkconc.: 1x
Penicilline-streptomycine Invitrogen15140163Voorraadconc.: 100x
Werkconc.: 1x
Fetaal runderserumLife TechnologyGecertificeerdWerkconc.: 4%
TPASigma-AldrichP1585Oplossen in DMSO
Voorraadconc.: 3,2 μM
Werkconc.: 32 nM
TransferrineSigma-AldrichT8158Oplossen in DPBS
Voorraadconc.: 0,1 mg/ml
Werkconc.: 1 μg/ml
Dibutyril cyclisch AMPSigma-AldrichD0627Oplossen in DPBS
Voorraadconc.: 0,5 mM
Werkconc.: 5 μM
InsulineSigma-AldrichI6634Oplossen in 10 mM azijnzuur
Voorraadconc.: 1 mg/ml
Werkconc.: 5 μg/ml
Basisch FGFBD Biosciences354060Oplossen in water
Voorraadconc.: 4 ng/μl
Werkconc.: 4 ng/ml

Referenties

  1. Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
  2. Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
  3. Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
  4. Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
  5. Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
  6. Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
  7. Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
  8. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
  9. Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
  10. Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cardiale melanocytenisolatie van melanocytendigestie van hartweefselenzymatische dissociatiecelkweekproceduretrypsine oplossingDPBS supplement40 micron zeefneonatale muizenhartenpatchclamp analyse

Gerelateerde artikelen