Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Dissection, Cultuur en Analyse van

13.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4377

⸱

23 december 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Xenopus laevis een ideaal model voor het bestuderen cellen lot specificatie en fysiologische functie van individuele retinale cellen in primaire celkweek. Hier wordt een methode voor het ontleden retinale weefsels en genereren primaire celculturen die afgebeeld voor calcium activiteit en geanalyseerd door in situ hybridisatie.

Samenvatting

Het proces waarbij het front van de neurale plaat leidt tot het vertebrate retina blijft een belangrijke focus van zowel klinisch en fundamenteel onderzoek. Naast de duidelijke medische belang voor het begrijpen en behandelen van retinale ziekte, de ontwikkeling van de vertebrate retina nog steeds als een belangrijk en elegant model voor begrip neuronale celtypen bepaling en differentiatie 1-16. De neurale retina bestaat uit zes discrete celtypes (ganglion, amacrine, horizontaal, fotoreceptoren, bipolaire cellen en gliacellen Müller) aangebracht in stereotype lagen, een patroon dat grotendeels geconserveerd onder alle gewervelde dieren 12,14-18.

Bij het bestuderen van het netvlies in het intacte ontwikkelende embryo is duidelijk nodig om te begrijpen hoe dit complexe orgaan ontwikkelt van een uitsteeksel van de voorhersenen in een gelaagde structuur, zijn er veel vragen die weer ten goede komenm dienst benaderingen met behulp van primaire celculturen van vermoedelijke retinale cellen 7,19-23. Bijvoorbeeld analyseren cellen van weefsels verwijderd en gedissocieerd in verschillende stadia kan men de stand van specificatie van individuele cellen onderscheiden in verschillende ontwikkelingsstadia, namelijk het lot van de cellen in afwezigheid van interactie met naburige weefsels 8,19-22 ,24-33. Primaire celkweek maakt ook de onderzoeker de cultuur behandelen met specifieke reagentia en de resultaten te analyseren op een enkele cel 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, een klassiek model voor de studie van vroege neurale ontwikkeling 19,27,29,31-32,40-42 dient als bijzonder geschikt voor retinale primaire celkweek 10,38,43-45.

Vermoedelijke retinale weefsel is bereikbaar vanaf de vroegste stadia van ontwikkeling, onmiddellijk na neurale inductie 25,38,43. Daar bovendien thbij elke cel in het embryo een voorraad dooier bevat, retinale cellen kunnen worden gekweekt in een zeer eenvoudige gedefinieerde media bestaande uit een gebufferde zoutoplossing, waardoor de tot verstorende effecten van incubatie of andere sera gebaseerde producten 10,24,44-45 .

Echter de isolatie van het retinale weefsel van de omringende weefsels en de daaropvolgende bewerking uitdaging. Hier geven we een werkwijze voor de ontleding en dissociatie van retinale cellen in Xenopus laevis die gebruikt worden om primaire celculturen die op hun beurt worden geanalyseerd op calcium activiteit en genexpressie op de resolutie van afzonderlijke cellen te bereiden. Terwijl het onderwerp in deze paper is de analyse van spontane calcium transiënten, de techniek is breed toepasbaar voor een breed scala aan onderzoeksvragen en-benaderingen (figuur 1).

Protocol

Alle experimenten worden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het College of William and Mary. Ontwikkelingsstadia waarnaar in dit protocol zijn volgens Nieuwkoop en Faber 46.

1. Ontleding

  1. Laat het celkweekmedium en Calcium Magnesium vrij medium (CMF) equilibreren tot kamertemperatuur. U zult ook moeten 0,1 x Marc's Gemodificeerd Ringer (MMR) pH 7,4-7,6.
  2. Steriliseer de volgende door een UV licht gedurende 30 min in een celkweek laminaire stroming kap. (Spuit elk item met 70% ethanol voordat u het in de kap.)
    • 35 mm kunststof petrischaaltjes.
    • 60 mm kunststof petrischaaltjes.
    • 35 mm Nunclon oppervlak gerechten.
    • 1,5 ml microcentrifugebuizen.
    • P1000 micropipet (1.000 ul micropipet).
    • Aerosol bestand P1000 tips (1.000 ul micropipet aerosol resistent tips).
    • Alcoholbestendig pen.
    • Fijn ontleden tang.
    • * 15 ml conische buizen (alleen voor imaging calcium activiteit).
    • * Alleen voor beeldvorming van calcium activiteit.
  3. Zodra de kap is UV gesteriliseerd en oplossingen moeten op kamertemperatuur komen, zet de laminaire luchtstroom in de kap, Spuit handschoenen en media flessen met 70% ethanol en plaats de media flessen in de motorkap.
  4. Binnen in de kap de voorbereiding van de volgende met een p1000 micropipet voor elke plaat van cellen, zorgen voor een passende etikettering.
    • Een 60 mm kunststof petrischaal met 10 ml celkweekmedium - Dissection Plate.
    • Een 35 mm Nunclon oppervlak schotel met 2 ml celkweekmedium - Cultuur Plate. (Nunclon plastic vaat niet verder behandeld met een lijm.)
    • Een lege 1,5 ml microcentrifugebuis-Explantatie Dissociatie Tube.
    • * Een 15 ml conische valkbuis met 15 ml celkweekmedium. Voor het wassen van het overtollige Fluo4-AM bij beeldvorming calcium activiteit.
  5. Binnen in de kap, de voorbereiding van de volgende met een p1000 micropipet voor elke dissectie sessie (meer dan een netvlies kan worden ontleed in een sessie).
    • Een 35 mm kunststof petrischaal met 2 ml CMF - Explantatie spoelen Plate.
    • Een 35 mm kunststof petrischaal met 2 ml CMF - Explantatie Dissociatie Plate.
  6. Buiten de kap de voorbereiding van de volgende:
    • Een 60 mm kunststof Petrischaal per plaat van cellen met 10 ml 0,1 x MMR - Holding Plaat.
    • Een 60 mm kunststof Petrischaal per plaat van cellen met 10 ml 0,1 x MMR - Broers en Plaat.
    • Een 60 mm plastic petrischaal per sessie dissectie met 10 ml 0,1 x MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (tricaine) - Plate verdoving.
  7. Voeg 40 ul 5% trypsine in CMF aan de Explantatie Dissociatie Plaat (resulterend in een 0,1% trypsine-oplossing), kolken te mengen, en zet apart.
  8. Als ontleden een embryo dat jonger is dan fase 30, voeg 10 mg collagenase B om de Dissection Plate (resulterend in een 1 mg / ml collagenase B-oplossing), zwenk om te ontbinden en zet apart.
  9. Selecteer een embryo van de gewenste fase, over te dragen aan de montageplaat met een niet-steriele pipet en verwijder de vitelline membraan (als het embryo nog niet uitgekomen) met behulp van fijne tang.
  10. Overdracht meerdere identieke geënsceneerd embryo's naar de Sibling Plaat met een niet-steriele transferpipet.
  11. Als het embryo fase 25 of eerder direct doorgaan met dissectie anderszins overdragen van de embryo de verdoving Plaat met een niet-steriele pipet en laat de embryo zitten totdat beweging en de reactie op stimuli eindigt. Dit kantot een minuut.
  12. Ga verder met dissectie (Figuur 2) onder een dissectie scope (4x objectief, 10x oculair).

Voor embryo stadium 25 of jonger:

  1. Transfer embryo naar de Dissection Plaat met een niet-steriele transferpipet.
  2. Gebruik van twee paar fijne forceps, een sagittale snede aan de ventrale zijde van het embryo, vanaf het achterste uiteinde en verder door de cement klier in het voorste gedeelte van de embryo.
  3. Open voorzichtig het embryo door grijpen de randen van de snede en het verspreiden van links en rechts. Dit resulteert in een embryo met de dorsale zijde in de plaat Dissection en de ventrale ectoderm opengespreid het endoderm en mesoderm in onthullen.
  4. Beginnen met het verwijderen van de endoderm en mesoderm (figuur 2A en 2B). De eerste en grootste laag van dit weefsel is "fluffy" in uiterlijk metgrote cellen en weinig duidelijk organisatie.
  5. Na het verwijderen laag, de somieten en notochorda zichtbaar. Voor beter contrast Verplaats de embryo een afzonderlijke 60 mm plastic petrischaal met 10 ml celkweekmedum en 100 pi 1% oplossing van Nile Blue Sulfate (in water) gedurende 2-3 minuten alvorens terug naar de Dissection Plate. Dit zal vlek het ectoderm, somieten, en notochord snellere identificatie en oriëntatie.
  6. Gericht op het voorste gedeelte van de embryo, verwijder de notochorda en alle resterende mesoderm blootstellen van de hersenen en optische vesicles (figuur 2C).
  7. Zodra de hersenen en optische vesicles volledig blootgesteld, met de tang om de neurale buis en onderliggende ectoderm juist achter de hersenen verbreken.
  8. Draai dit deel (de hersenen en het optische blaasjes) om, zodat de ectoderm is op de top.
  9. Zorg ervoor dat u de onderliggende optische blaasjes schade, zorgvuldig bentverplaatst het ectoderm (figuur 2D).
  10. Tenslotte behulp van een tang, scheiden de optische vesicles van de hersenen (figuur 2D en 2E).

Voor embryo's ouder dan stap 25:

  1. Hoewel het embryo in de verdoving Plate, verwijder het ventrale gedeelte van de embryo met forceps.
  2. Voor beter contrast Verplaats de embryo tot 60 mm plastic petrischaal met 10 ml 0,1 x MMR en 100 pi 1% Nile Blue sulfaat gedurende 2-3 minuten alvorens naar de Dissection Plate. Dit zal vlek het ectoderm blauw.
  3. Eenmaal in de Dissection Plate, trek de ectoderm bovenop het netvlies (of optische blaasje voor de embryo's stadium 26-30) (figuur 2F en 2G). Als Nile Blue sulfaat werd gebruikt, zal het ectoderm worden blauw gekleurd maar de onderliggende retinale weefsel niet.
  4. Verwijder voorzichtig de retina of optische blaasje met forceps (figuur 2h, 2i en 2J). Het is nuttig om de embryo plaats houden met een pincet en de retina of optische vesicle met de andere te verwijderen.

2. Dissociatie van weefsels en Plating van cellen

Belangrijk - Bij het ​​overbrengen van weefsels, niet toestaan ​​dat de retina of optische blaasje aan een lucht-vloeistof grenzen raken, als dit het geval is zullen de cellen te lyseren.

  1. Zodra de optische blaasje of retina is ontleed, voorzichtig overbrengen naar het explantaat spoelen Plaat met een micropipet met p100 aerosol dopjes en laat zitten voor 30 sec.
  2. Breng 80 pl van 0,1% trypsine in CMF van het explantaat Dissociatie Plate de explantatie Dissociation Tube.
  3. Met behulp van een p100 micropipet en aerosol bestendig tips, de retina of optische blaasje te brengen van de Explantatie Spoel plaat aan de Explantatie Dissociatiop Tube, voorkomen van het overbrengen van de explantaten spoeloplossing.
  4. Laat het weefsel in het explantaat Dissociation Tube dissociëren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Een retina werd gebruikt per plaat, maar we dat het mogelijk is om meer dan een per plaat gebruiken als gewenst om het aantal cellen per plaat vergroten.
  5. Om de plaat cellen eerst langzaam verwijderen 40 pi van de oplossing van het explantaat Dissociation Tube en gooi met een micropipet en p100 aerosol dopjes. Met behulp van een p100 ingesteld op 40 pi en aerosol bestendig tips, de overdracht van de cellen (nu dat het weefsel gedissocieerde heeft) in de petrischaal. Wanneer de cellen afzuigen op de plaat langzaam pipetteren en houden de cellen in een klein gebied in het midden van de plaat.

Opmerking: als meerdere beelden van de cellen worden de tijdens het experiment, sluit een rooster (Cellattice) aan de onderzijde van de petrischaal met een klein druppeltje superlijm. Hierdoor kunnen beelden van identieke cellen in dezelfde oriëntatie aan die op diverse punten in de procedure.

  1. Laat de cellen ongestoord zitten gedurende ten minste 1 uur te houden aan de Nunclon plaat. Na deze tijd, moeten zij zeer voorzichtig worden behandeld of ze kunnen raken.
  2. Kweekcellen gewenste fase en houdt de sibling embryo's die gekweekt bij dezelfde temperatuur als de cellen. Als levende cellen niet worden gebruikt voor verdere manipulatie, kunnen ze worden vastgesteld MEMFA oplossing op dit moment.

Belangrijke opmerking: De meeste van onze experimenten worden vastgesteld binnen 6 uur van plateren de cellen. De levensduur van de cellen in kweek is afhankelijk van de fase waarin het weefsel werd ontleed en de hoeveelheid dooier nog aanwezig in de cellen, cellen geprepareerd uit jongere (neurula stadia) gezond blijven in kweek gedurende 5-6 dagen, terwijl cellen verkregen van ouder embryo's (zwemmen kikkervisjestadia) levensvatbaar zal blijven in cultuur voor 2-3 dagen.

3. Calcium Imaging 47 tot 49

Dit protocol maakt gebruik van calcium-gevoelige Fluo4-AM en confocale microscopie aan calcium transiënten kwantificeren in individuele cellen. Alle stappen met behulp van Fluo4-AM dient te worden uitgevoerd uit de buurt van licht, zoals Fluo4-AM is lichtgevoelig. Alle wassingen moeten worden toegevoegd of verwijderd met een p1000 micropipet en aerosol-resistente tips. Pipetteren en langzaam naar de rand van de plaat te vermijden, dat de cellen worden gedaan. Het papier is niet veranderd omdat de culturen zijn over het algemeen vastgesteld binnen 6 uur te worden ontleed. Langere termijn kweken moeten de media dagelijks veranderd.

  1. Fluo4-AM opgeslagen bij -20 ° C, en stellen voor opslag in 5 pi aliquots. Voordat u, ontdooi een 5 ul aliquot van Fluo4-AM uit de buurt van licht en voeg 2 pl Pluronic F-127 rechtstreeks op deze hoeveelheid.
  2. Na kweken van de cellen voor de gewenste tijd (min.1 uur), verwijderen 1 ml van de celkweek medium van de petrischaal. Voeg dit toe aan de Fluo4-AM en Pluronic, mengen door voorzichtig pipetteren.
  3. Langzaam terug overdracht van al deze oplossing aan de rand van de petrischaal van de cellen af te beelden en laat de cellen in deze oplossing ongestoord gedurende 1 uur de Fluo4-AM absorberen.
  4. Uit te spoelen overtollige Fluo4-AM van de celkweek medium, voert u de volgende wasbeurt serie:
    • Verwijder 1 ml van de media van de plaat.
    • 3 ml vers kweekmedium (de 15 ml conische buis) aan de plaat.
    • Voer twee extra wassingen telkens langzaam verwijderen 3 ml oplossing uit de plaat en het toevoegen van 3 ml vers celkweekmedium.
  5. De cellen moet nu in 4 ml van het celkweekmedium en bevatten Fluo4-AM. Fluo4-AM wordt enzymatisch gesplitst eenmaal in de cel, zodat het niet diffunderen uit de cel of in een membraangebonden compartimenten.
  6. Voor het laden van de plaat op het podium van de confocale microscoop voor beeldvorming, trek een verticale rode lijn met permanent marker op de schotel terwijl deksel op tot markeerdraad deeltjes te voorkomen dat besmetting van de cultuur. De verticale lijn wordt getrokken langs de zijkant van de petrischaal (de basis van de petrischaal, niet het deksel). Het doel is om de oriëntatie van de petrischaal geven met betrekking tot het gezichtsveld zodat de precieze oriëntatie en uitlijning van de individuele cellen kunnen worden hersteld op een later tijdstip.
  7. De plaat is nu gereed voor het laden van de fase van de confocale microscoop voor beeldvorming. Visualiseer de cellen met behulp van de helderveld instellingen op een laser scanning confocale microscoop (20X objectief). Zoek een gebied van dichte cellen dat geen klontjes, bij voorkeur met een veld van mening dat de grote raster nummers op de Cellatice dekglaasje om het vinden van hetzelfde gezichtsveld gemakkelijker later bevat wanneer de beeldvorming van de cultuur na in situ hybridisatie. Voorafgaand aan beeldvorming, scherpstellen door de cultuur en neem een ​​helderveld beeld van de onderstaande tabel de cellen naar de plaats en oriëntatie van de celkweek op te nemen. Dit zorgt voor aanpassing van de cellen voor verdere analyse.
  8. Til de focal plane en het veroveren van een helder veld beeld van de cellen voor het begin van calcium imaging (Figuur 3A).
  9. Zodra het middenvlak van de cellen in focus, de plaat klaar voor beeldvorming van calcium activiteit. Instellingen zullen variëren afhankelijk van de microscoop en de toepassing. We beeld de cellen met een Argon laser 488 nm voor 1, 2 of 12 uur met de volgende parameters:
    • 1 uur foto's:
      • Argon 488 nm laser scant op 4% van zijn maximale 30 mW vermogen.
      • Scan eens in de 4 sec (900 scans per uur).
    • 2 uur afbeeldingen:
      • Argon 488 nm laser scant op 4% van zijn maximale 30 mW vermogen.
      • Scan een keer per8 sec (450 scans per uur).
    • 12 uur afbeeldingen:
      • Argon 488 nm laser scant op 2% van zijn maximale 30 mW vermogen.
      • Scan eenmaal per 48 sec (75 scans per uur).

Deze parameters zal resulteren in een set van 900 stilstaande beelden per periode. Calcium activiteit kan dan worden opgenomen door analyse fluorescentie niveaus gedurende het tijdsverloop beelden (Figuur 3B) met behulp van een beeldbewerkingsprogramma zoals ImageJ 50.

4. Bevestiging Cellen

  1. Na imaging kunnen cellen worden vastgesteld op 30 min door het verwijderen van 3 ml oplossing uit de plaat en het toevoegen van 1 ml 2X MEMFA de resterende 1 ml kweekmedium.
  2. Na fixatie en drogen verwijderen MEMFA cellen met een reeks van 5 min wassingen, elk een volume van 1 ml:
    • 25% ethanol in 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    • 50% ethanol in 1X PBS.
    • 75% ethanol in sdd H 2 O (steriel gedeïoniseerd gedestilleerd water).
    • Vervang de laatste wassing met 1 ml 100% ethanol en bewaar plaat bij -20 ° C.

Opmerking: Methanol kan ook worden gebruikt voor deze wasbeurten en voor opslag.

5. Fluorescente in situ hybridisatie (FISH)

Culturen kan worden geanalyseerd met de standaard FISH protocol voor Xenopus beschreven 51 met wijzigingen voor celkweek als geschetst in het Anderson Lab 52. Wijzigingen aan de Anderson Lab protocol worden hieronder vermeld. Alle wassingen wordt uitgevoerd op 35 mm platen in Nunclon volumes van ongeveer 1 ml, tenzij anders aangegeven. Oplossingen zijn zoals gedefinieerd in Sive et al. 53. Tenzij anders vermeld.

Belangrijke opmerking: Gebruik geen fluoresceïne-gelabelde RNA-probes bij het ​​uitvoeren van in situ hybridisatie op cellen afgebeeld voorcalcium-activiteit. Anti-fluoresceïne antilichamen binden aan residuele Fluo4-AM in de cellen en kan positief signaal in alle cellen in de cultuur veroorzaken.

Dag 1: Permeabilisatie en hybridisatie

  1. Rehydratatie wasbeurten moeten worden ingedeeld naar de uitdroging oplosmiddel gebruikt voor opslag. Voor onze experimenten werden wassingen gedegradeerd tot ethanol in 1X PBS.
  2. Na rehydratatie, was de cellen drie keer extra in 1X PBS gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur.
  3. Meng 25 ml 0,1 M triethanolamine (pH 8,0) met 62,5 pi azijnzuuranhydride in een Falcon buis en snel mengen tot grondig gedispergeerd zoals besproken in de Anderson Lab 52 protocol. Incubeer culturen in dit mengsel gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Na azijnzuuranhydride behandeling wassen cellen in 1X saline natriumcitraat (SSC) gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder de laatste SSC gewassen en vervangen met 0,2 M HCl (in SDD H 2 O) gedurende 10 min aan cellen permeabiliseren.
  5. Spoel HCl twee wasbehandelingen in 1X PBS gedurende 5 minuten.
  6. Prehybridize in ISH buffer bij 60 ° C in een schuddend waterbad gedurende ten minste 6 uur, maar niet prehybridize nachts als deze ernstig vermindert signaal.
  7. Hybridiseren gedurende de nacht bij 60 ° C voor 8-14 uur in 750 pl verdunde probe (1:250 verdunning van een gezuiverd probe). Het gezuiverde probe concentratiebereiken 1.0 tot +1,5 ug / ul.

Dag 2: verwijdering van ongebonden Probe en Antilichaam Incubation

  1. Verwijder de probe en spoel culturen gedurende 5 min in 0,2 x SSC bij 60 ° C. Wassen in vers 0,2 X SSC gedurende 1 uur bij 60 ° C.
  2. Verwijder culturen uit het waterbad en laat ze op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  3. Spoel in 0,2 x SSC bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  4. Wassen 15 min in 1X PBS met 0,1% Triton-X-100 (PBT).
  5. Endogeen peroxidasen inactiveren, wassen gedurende 1 uur in een 2% H 2 O 2-oplossing in PBT.
  6. Spoel met een 15 min wassen in 1X Tris gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBST).
  7. Blok in 2% Blocking Reagent in maleïnezuur Buffer (MAB) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. We hebben gevonden dat deze werkwijze blokkeren gevoeligheid verhoogt in vergelijking met eerdere methoden blokkeren in 20% serum in schapen PBT.
  8. Incubeer kweken in 1 ml 2% Blocking Reagent in MAB met een 1:1000 verdunning van een POD-geconjugeerde antilichaam overnacht bij 4 ° C.

Dag 3: Verwijdering van niet-gebonden antilichaam en Fluorescentie Ontwikkeling

  1. Verwijder antilichaam en spoel 3 keer in TBST gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  2. 4 keer wassen in TBST gedurende 15 min bij kamertemperatuur onder voortdurend schommelen op lage snelheid.
  3. Tweemaal spoelen in PBT bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  4. 750 ul van toepassing 1:200 fluoresceïne tyramide of 1:25 verdund Cy3 tyramide in PBT. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en voeg 2,5 ui 0,3% H 2 O 2. Rock gedurende 40 minuten om een ​​signaal te ontwikkelen.
  5. Wassen minstens 4 maal gedurende 15 min elk in TBST bij kamertemperatuur schudden.
  6. Zodra signaal volledig ontwikkeld was voor 5 min in 1X PBT.
  7. Fix in 1X MEMFA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en opslag in 1X PBS bij 4 ° C.

6. Afbeelding FISH Resultaten en Co-registreert bij een Calcium Imaging gegevens

  1. Na voltooiing van FISH worden celkweek-platen belicht te bepalen welke cellen vertonen een positief fluorescentiesignaal voor een bepaalde probe. Gebruik de Cellattice dekglaasje de exacte gezichtsveld bestudeerd tijdens calcium imaging vinden en de plaat af te stemmen op de oriëntatie van het calcium beeldrasters.
  2. Concentreren van het middenvlak van de cellen en maak een hoge resolutie met de Helium-Neon HeNe-laser bij 543 nm 15% van de maximale 1 mW vermogen (Figuur 3C).
  3. In de oorspronkelijke 900 chassis set van beelden uit de Calcium Imaging-protocol,identificeren afzonderlijke cellen gebieden van belang (ROI) door het gebruik van een beeldbewerkingsprogramma (zoals ImageJ 50). Extract ROI fluorescentie gegevens als een verzameling data die representatief time-fluorescentie paar waarden (Figuur 4).
  4. Overlay de FISH resultaten beeld met de geïdentificeerde ROI van de calcium-beelden (Figuur 3D).
  5. Geef iedere ROI als positief voor de probe, negatief voor de probe, of onbekende - in het geval dat de cel overeenkomt met de ROI niet meer worden gevonden binnen het gezichtsveld van de vissen.
  6. Proces ROI fluorescentie gegevens met behulp van statistische analyse scripts (zoals ontworpen door MATLAB of andere programmeertaal) bent voor calcium activiteit te vergelijken tussen de verschillende doorsneden fasen (figuur 5a en 5c) of cellen positief voor verschillende FISH probes (Figuur 5B en 5D). Alle scripts die in ons lab zijn vrij beschikbaar op aanvraag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voorbeelden van succes ontleed optische vesicles (fase 25) en retinae (trap 35) worden getoond in de figuren 2E en 2J. Hoewel dit protocol kunnen worden gebruikt in verschillende stadia van ontwikkeling, is het essentieel om alleen netvliesweefsel verkrijgen nauwkeurigheid voor verdere experimenten waarborgen. Verwijder voorzichtig de opperhuid in alle stadia en ervoor te zorgen dat uw tang niet doorboren de retinale weefsel. In fase 35 jaar of ouder, kan de lens worden beschouwd als een heldere laag bo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met zijn goed gekarakteriseerd celtypen die geconserveerd zijn in alle vertebraten, de retina een nuttig model voor het bestuderen van de moleculaire cellulaire processen die celtype specificatie en differentiatie. Primaire celkweek biedt een krachtige methode voor het onderzoeken van een groot aantal processen waaronder genexpressie, eiwit dynamiek en calcium en elektrische activiteit op het niveau van enkele cel resolutie. Hier presenteren we een eenvoudige techniek voor het primaire celkweek van ontleed vermoedelijke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

We genadiglijk danken Dr John Hayes voor scripts; Drs. Eric Bradley en Christopher Del Negro voor hulp bij confocale microscopie; Drew Hughes, Laura ODORIZZI, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, en Liz MacMurray voor hun werk in de ontwikkeling van het project en het verstrekken van voorlopige gegevens, dr. Greg Smith voor nuttige suggesties op de statistische analyse. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie ​​(NINDS IR15N5067566-01) voor MSS en een Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant aan het College of William and Mary.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer
Voor Dissections en kweken
BD Falcon Easy Grip weefselkweekplaten, 35 mm Visser 08-772A
Eenmalige polystyreen Petrischalen, 60 x 15 mm Visser 0875713A
35 mm Nunclon Oppervlakte Petrischalen (met Airvent) Visser 12-565-91
Dumont Fijne tang (Dumostar # 55) Visser NC9341917
Cellattice Micro-geregeerd kunststof dekglaasje, 25 mm Visser 50-313-17
Ethyl-m-aminobenzoaat methaansulfonaatzout (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicinesulfaat Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco trypsine (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase uit Clostridium histolyticum B Roche 11088831001
Penicilline-streptomycine Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfaat (optioneel) Pfaltz & Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter / Storage Bottle System, 0,22 pm Pore 33,2 cm 2 GN-Membraan Corning 430758
Voor Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM oplossing in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% oplossing in water Life Technologies P-6866
LSM 510 confocale microscoop System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
Voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)
Anti-digoxigenine-POD, Fab fragmenten Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP antilichaam Perkin-Elmer NEL747A
Cy3NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-fluoresceïne Thermo Scientific 46409
Formamide, gedeïoniseerd Amresco 0606-capaciteit van 950
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparine Natrium Zout, van Varkens darmslijmvlies Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Tabel 2. Specifieke reagentia en apparatuur.

Oplossing Verwijzing Inhoud
Celkweekmedium Chang en Spitzer, 2009 54 116 mM NaCl
0,67 mM KCl
2 mM CaCl2
1,31 mM MgSO4
4,6 mM Tris
1% (v: v) Penicilline / Streptomycine
Breng de pH tot 7,8 met HCl.
Filter steriliseer door passage door een 0,22 urn filter CN.
Bewaar bij 4 ° C.
Calcium-Magnesium Gratis Medium (CMF) Gu et al., 1994 42;. Gu en Spitzer, 1995 55 116 mM NaCl
0,67 mM KCl
4,6 mM Tris
0,4 mM EDTA
1% (v: v) Penicilline / Streptomycine
Breng de pH tot 7,8 met HCl.
Filter steriliseer door passage door een 0,22 urn filter CN.
Bewaar bij 4 ° C.
Maleïnezuur Buffer (MAB) Sive et al.., 2000 53 100 mM maleïnezuur
150 mM NaCl (pH 7,5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al.., 2000 53 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH ingesteld op 7,4 met NaOH
0,1 x MMR bevat ook 50 mg / ml gentamicinesulfaat en pH op 7,4 met NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al.., 2000 53 0,1 M MOPS (pH 7,4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3,7% formaldehyde
Een 10X oplossing zonder formaldehyde kan worden opgeslagen bij 4 ° C. Formaldehyde toegevoegd vers (1/10 volume van een standaard stock 37%).
In situ hybridisatie Buffer Sive et al.., 2000 53 50% Formamide
5X SSC
1 mg / ml RNA Torula
100 mg / ml heparine
1X Denhart's Solution
0,1% Tween 20
0,1% CHAPS
10 mM EDTA.

Oplossingen. * Gentamicine, een antibioticum, wordt in onze MMR oplossingen, terwijl penicilline en streptomycine worden gebruikt in onze kweekmedia.

Referenties

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110(2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940(2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11(2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Xenopus retinawefseldissectie van de retinaretinacelcultuurcalcium imagingconfocale microscopieweefseldissociatieprimaire celcultuurembryonale ontwikkelingneurobiologische methodencelanalyse
Dissection, Cultuur en Analyse van
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.