Methodenartikel

Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe

DOI:

10.3791/4381

⸱

24 februari 2013

 ,  , 
1Department of Biology, University of Washington

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Olfactorische signalen bemiddelen veel verschillende gedragingen in insecten, en zijn vaak complexe mengsels bestaat uit tientallen tot honderden vluchtige verbindingen. Met gaschromatografie met meerkanaals opname in het insect antennelid lobe beschrijven we een werkwijze voor de identificatie van bioactieve verbindingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle organismen bewonen een wereld vol van zintuiglijke prikkels die hun gedrags-en fysiologische reactie op hun omgeving te bepalen. Reukzin is vooral belangrijk in insecten, die hun olfactorische systemen te reageren op en onder complexe geur stimuli. Deze geuren roepen gedragingen die bemiddelen processen, zoals reproductie en habitat selectie 1-3. Bovendien, chemische detectie door insecten bemiddelt gedragingen die zeer belangrijk zijn voor de landbouw en de menselijke gezondheid, met inbegrip van bestuiving 4-6, herbivorie van voedingsgewassen 7 en overdracht van ziektes 8,9. Identificatie van olfactorische signalen en hun rol in insecten gedrag is dus belangrijk voor het begrijpen van zowel ecologische processen en menselijke voedselbronnen en welzijn.

Tot op heden heeft de identificatie van vluchtige stoffen die insecten gedrag sturen is moeilijk en vaak vervelend. Huidige technieken omvattengaschromatografie gekoppelde electroantennogram opname (GC-EAG), en gaschromatografie gekoppelde enkele sensillen opnamen (GC-SSR) 10-12. Deze technieken bleken vitaal belang in de identificatie van bioactieve verbindingen. We hebben een methode ontwikkeld die gaschromatografie gekoppeld aan multi-channel elektrofysiologische opnamen (aangeduid als 'GCMR') van neuronen in de antennaal kwab (AL; van het insect primaire olfactorische centrum) maakt gebruik van 13,14. Deze state-of-the-art techniek stelt ons in staat om door te dringen hoe geur informatie is vertegenwoordigd in het insect hersenen. Bovendien, omdat neurale respons op geuren op dit niveau van verwerking geur zeer gevoelig vanwege de mate van convergentie van de antenne receptor neuronen in AL neuronen zal AL opnamen de detectie van actieve bestanddelen van natuurlijke geuren efficiënt en met hoge gevoeligheid. Hier beschrijven we GCMR en een voorbeeld geven van het gebruik ervan.

Een aantal algemene stappen zijn INVOLmj in de detectie van bioactieve vluchtige en insecten reactie. Vluchtige stoffen moeten eerst worden verzameld uit bronnen van belang (in dit voorbeeld gebruiken we bloemen uit het geslacht Mimulus (Phyrmaceae)) en gekarakteriseerd als dat nodig is met behulp van standaard GC-MS technieken 14-16. Insecten worden bereid voor onderzoek met minimale dissectie, waarna een registratie-elektrode wordt in de antennelid kwab en meerkanaals neurale opname begint. Post-verwerking van de neurale gegevens blijkt dan welke specifieke geurstoffen belangrijke neurale reacties veroorzaken door het zenuwstelsel van een insect.

Hoewel het voorbeeld we hier specifiek is voor bestuiving studies kunnen GCMR worden uitgebreid met een groot aantal studie organismen en vluchtige bronnen. Zo kan deze methode worden gebruikt bij de identificatie van geurstoffen aantrekken of afstoten vector insecten en plagen. Bovendien kan GCMR ook worden gebruikt om lokstof identificeren voor nuttige insecten zoals pollinators. De techniek kan worden uitgebreid naar niet-insect vakken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vluchtige Follection

  1. In dit voorbeeld worden vluchtige monsters van M. lewisii bloemen - een alpine wilde bloemen afkomstig uit Californië. Vluchtige stoffen worden verzameld via dynamische sorptie werkwijzen volgens Riffell et al.. 14. Kortom, deze werkwijze gebruikt een gesloten lus opvangsysteem waar bloemen bevinden zich in een Teflon zak. Met een inert vacuümpomp wordt de lucht rond de bloemen opgezogen door een "trap" uit een Pasteur pipet vol Porapak Q matrix. De retourlucht uit de pomp wordt gefilterd door geactiveerde kool. Na een bepaalde tijdsperiode, in ons geval 24 h wordt de Porapak Q matrix geëlueerd met een niet-polair oplosmiddel, typisch hexaan, het geconcentreerde extract verzamelen. Het extract wordt dan opgeslagen in -80 ° C tot analyse. Indien nodig kunnen de monsters vóór de analyse worden geconcentreerd onder een stroom stikstofgas. Tenzij het monster is al goed gekarakteriseerd, voert u een portie van het door eengaschromatograaf-massaspectrometer (GC-MS) voorafgaande identificeren vluchtige componenten met het monster.

2. Elektrofysiologische Voorbereiding

  1. Snij ongeveer 1 cm vanaf het einde van een 1.000 ul pipetpunt. Plaats een hommel (Bombus impatiens) in de basis van de pipetpunt en duw in de richting van het andere uiteinde van de tip tot alleen het hoofd wordt blootgesteld.
  2. Smelt tandtechnische waspreparaten en schimmel het rond de blootgestelde hoofd, zorg ervoor dat de wax hecht op het samengestelde ogen voor de veiligheid en om de bij het hoofd volledig immobiel is. Zorg ervoor dat er geen wax te krijgen op de antenne van de honingbij.
  3. Zodra het hoofd is veilig, een vierkant maken, raam-achtige, insnijding in het hoofd capsule met behulp van een scheermesje-breaker of de juiste maat scalpel om de cuticula te snijden. Met de blade-breaker, beginnen de dorsale zijde van het hoofd capsule, direct achter de antenne en grenzend aan een van de samengestelde ogen. Snijdeneen rechte lijn, van een verbinding met de contralaterale oog samengestelde oog. Na het snijden van een rechte lijn naar de andere samengestelde oog, het maken van een incisie dorsaal beginnen voordat het hoofd capsule bochten en eindigt nabij de thorax. Op dit punt begint te snijden naar de andere kant van de kop capsule. Ten slotte, wanneer een lijn is teruggebracht tot de andere kant, bezuinigen een lijn naar de uitgangspositie van de eerste incisie. Het is belangrijk verwijderen cuticula dat grenst aan de antenne, aangezien dit belemmert het inbrengen van de elektrode.
  4. Zodra de cuticula wordt gesneden, gebruik een pincet om de bij cuticula, die dan zou moeten blootstellen van de bij hersenen en, nog belangrijker, de antennaal lobben te verwijderen. Onmiddellijk beginnen superfusing de hersenen met insect zoutoplossing, zodat de hersenen niet wordt uitgedroogde vorm. Nadat de hersenen wordt blootgesteld, zorgvuldig gebruik maken van een paar zeer fijne tang om de perineurale omhulsel te verwijderen direct boven de antennaal lobben. Wees voorzichtig niet tedoorboren de bij de hersenen met de tang.

3. Gaschromatografie met multi-channel recording

  1. De bee "preparaat" - gefixeerd in een buis met blootgestelde hersenen - is nu klaar voor elektrofysiologische opnames. Plaats de bij in een klem bevestigd aan een magnetische basis die zich op een lucht tafel.
  2. Regelen van een infuuszak, stroomregelaar en buizen (gevuld met saline insect) zodat de zoutoplossing continu de hersenen superfuses.
  3. Met behulp van een micromanipulator, insertareference elektrode, gemaakt van wolfraam draad, in het oog van de bijen.
  4. Met een afzonderlijke micromanipulator Plaats de meerkanaals elektrode, zoals een spiraaldraad tetrode of silicium meerkanaals elektrode (Neuronexus Technologies) in de antennaal lobben van de honingbij. Deze electrode is verbonden met een voorversterker zoals S-3 TDT het systeem Z serie met de Z-bus bioamp processor van de TDT systeem. Uitvoer van de Gas Chromatogram de detector via een afgeschermde BNC kabel kan worden aangesloten op de versterker en data acquisitie systeem, dat zowel de neurale en GC signaal gesynchroniseerd.
  5. Wacht ongeveer 30-60 minuten voor de neurale opnames te stabiliseren. Zodra de spontane activiteit en golfvorm van eenheden in de opname kanalen geworden consistent met een geur spuit de bij stimuleren en de respons van de opname kanalen om de geur te observeren.
  6. Opnemen extracellulaire spikes van neuronen door auto-drempelen de opname kanalen 3,5 tot 5 sigma van het signaal op de individuele opname kanalen. Handmatig drempelwaarde kan nodig zijn voor sommige kanalen om besmetting van elektrische ruis te voorkomen. De actiepotentialen van neuronen zal verschijnen als spanningspieken in de opname kanaal. Wanneer het kanaal spanning de drempel overschrijdt, het systeem buffers en slaat de enkele milliseconden vóór en na het overschrijden van de drempelwaarde, waardoor takinga snap-shot van de golfvorm, of spike.
  7. Direct naast de lucht tabel is de GC. Voor het injecteren van de bloemen-extract in de GC, zorg ervoor dat de methode voor de temperatuurverhoging van de GC run correct is. In ons voorbeeld gebruiken we een methode temperatuur vanaf 50 ° C gedurende 4 min gevolgd door een verhoging van de temperatuur met een snelheid van 10 ° C / min. tot 220 ° C, waarna wij het GC gedurende 6 min. We gebruiken een DB-5 GC kolom (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), met helium als draaggas. De inlaat is splitless, met een temperatuur tot 200 ° C. De vlamionisatiedetector temperatuur op 230 ° C.
  8. Injecteer het extract steekproef van de bloemen headspace in het verwarmde injectiepoort van de GC om de geadsorbeerde vluchtige stoffen vrijkomen in de GC-kolom. Het effluent uit de kolom wordt gesplitst 1:1 tussen de vlamionisatiedetector (FID) en de bij antenne met een glazen "Y" connector (J & W Scientific). Begin recording van de elektrode als je een monster te injecteren in het GC.
  9. Na de GC run is voltooid, laat de bereiding rusten gedurende 5 tot 15 minuten. Vervolgens injecteren een monster in de GC of stimuleren de preparatie met enkele vluchtige verbindingen of mengsels van verbindingen. In deze laatste werkwijze voor het stimuleren van de bereiding worden pulsen van lucht van een constante luchtstroom omgeleid door een glazen spuit met een stuk filtreerpapier waarop de verbindingen zijn gedeponeerd. De geur stimulus werd gepulseerd met een elektromagnetische klep geactiveerd door de software.
  10. Als eenheid activiteit plotseling stopt of verandert, controleer dan de zoutoplossing druppelen en laat de voorbereiding rusten gedurende 15 minuten. Als de spontane activiteit niet weer bij het oude niveau wordt het preparaat moet worden weggegooid en een andere bijen gebruikt, indien beschikbaar.
  11. Na het experiment vast de hersenen met 5% formaline gedurende 20 min met de probe nog in het weefsel. Vervolgens accijnzen de hersenenen plaats deze in 2% glutaaraldehyde gedurende 4 uur, en vervolgens doe een gegradeerde ethanol uitdroging serie en duidelijk de hersenen met methylsalicylaat. Op basis van de vaststelling en verrekening van het weefsel, de locaties in de AL waar de elektroden doorboord het weefsel moet duidelijk waarneembaar zijn door confocale microscopie.

4. Data-analyse

  1. Analyseer de verzamelde gegevens na het experiment te scheiden en identificeren van de opgenomen neurale eenheden. Gebruik typische softwareprogramma's (Offline Sorter, MClust, en SClust) te scheiden golfvormen, of "spikes", gebaseerd op spike vormen, zoals piek of dal amplitude, piek halve breedte, enz., of verminderde maatregelen (principale componenten) 17 , 18 (figuur 2). Alleen die clusters van pieken die gescheiden in de driedimensionale ruimte (PC1-PC3) en statistisch verschillend zijn van elkaar (multivariate ANOVA p <0,05) (Figuur 2) voor verdere analyse. Raadpleegcitaat # s 17 tot 19 voor de volledige beschrijving van tetrode opname en spike-sorteren methodieken.
  2. Tijdstempel pieken in elke cluster, en exporteer deze gegevens voor analyse met behulp van MATLAB of Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) naar raster percelen en vuursnelheid reacties (figuren 2, 3A) te creëren.
  3. Identificeer de retentietijden van vluchtige stoffen met behulp van de gelijktijdig opgenomen GC-gegevens. Gebruik de retentietijden van de vluchtige stoffen, door de top van de piek van het chromatogram te onderzoeken apparaat reageert op die tijdstippen.
  4. Om individuele eenheid reacties te onderzoeken door de GC run, bak het aantal pieken in de 100 msec intervallen en onderzoekt het tijdsverloop van de vuursnelheid reacties met betrekking tot de retentietijd van eluting vluchtige stoffen. De binning van pieken in 100 msec intervallen levert voldoende gegevens of signalen over het tijdsverloop van de neuronale respons op een geurstof elueren van GC.
  5. Om EXAmijnen bevolking reacties op de verschillende eluting vluchtige integreren de vuursnelheid reacties van individuele eenheden over een bemonsteringsperiode 3 sec, 1,5 sec vóór en 1,5 sec na de retentietijd van de vluchtige (figuur 3). Deze periode is kenmerkend voor de duur van een vluchtige eluerende van GC. We tonen vuursnelheid reacties van de eenheden door kleurcodering hen (rood is een hoge vuursnelheid reactie; blauw is een lage respons) en het regelen van hen als een activiteit matrix waarbij elke rij die de ensemble reactie op de GC effluent (kolommen) ( figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de assay met de GCMR M. lewisii bloemengeur, we injecteren 3 pl van het extract in de GC. Het totale aantal vluchtige elueren door de GC typisch 60-70 vluchtige stoffen. De geur van M. lewisii bestaat voornamelijk uit monoterpenoids, zoals β-myrceen (acyclisch) en α-pineen, waarbij de rest van de geur uit zes koolstof-vluchtige, zoals 2-hexanol en sesquiterpenoiden dat <1% van de headspace omvatten.

GCMR maakt gebruik van de gevoeligheid van neuronen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insect olfactorische-gemedieerde gedrag rijden veel verschillende processen, waaronder reproductie, host-selectie van locaties, en de identificatie van geschikte voedselbronnen. De studie van deze processen vereist het vermogen om de vluchtige stoffen die uit de bron, en het vermogen om die verbindingen die bemiddelen het gedrag identificeren identificeren. Complicerende zaken is dat geuren bestaan ​​uit tientallen tot honderden verschillende verbindingen die samen een unieke geur die anders wordt ervaren dan de afzonde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie ​​IOS 1121692, en door de Universiteit van Washington Research Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van item Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Porapak Type Q 80 tot 100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Tassen Reynolds
GC Agilent 7820A
GC kolom J & W Scientific, Folsom, Californië, USA DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 urn)
Analytische helium draaggas Praxair HE K 1 cc / min
16-kanaals silicium elektrode Neuronexus Technologieën a4x4-3mm50-177
Fijne draad NiCr, 0,012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 Voor het maken van custom tetrodes en stereotrodes
Pre-versterker Tucker-Davis System PZ-2
Versterker Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisitie systeem - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sortering software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sortering software - Mclust Spike-sorteren toolbox David Redish, Afdeling Neurowetenschappen, Universiteitof Minnesota Gratis te downloaden op http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570(1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725(2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489(2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440(2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098(2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282(2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382(2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Olfactory VolatilesGas ChromatographyMulti unit RecordingsInsect Antennal LobeBumblebee BrainNeural RecordingsFloral HeadspaceElectrodes InsertionGCMR TechniqueVolatile Detection

Gerelateerde artikelen