Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats van In vivo Experimentele systemen.

Samenvatting

Een basisvereiste voor onderzoekers die met adaptieve immuniteit in vivo experimentele modellen is het vermogen om T-cellen op basis van hun T-cel antigen receptor (TCR) specificiteit identificeren. Veel indirecte methoden beschikbaar waarin een bulk populatie van T-cellen wordt gestimuleerd in vitro met een specifiek antigeen en epitoop-specifieke T-cellen worden geïdentificeerd door het meten van een functionele reactie zoals proliferatie, cytokine productie of expressie van merkers van activering ^1. Echter, deze methoden alleen identificeren epitoopspecifieke T-cellen vertonen een van de vele functies en zijn niet gevoelig genoeg om epitoop-specifieke T-cellen te detecteren op naïeve precursor frequenties. Een populair alternatief is de TCR transgene adoptieve transfer model, waarbij monoklonale T-cellen van een TCR transgene muizen worden geënt in histocompatibel hosts een groot precursor populatie van epitoop-specifieke T-cellen die kunnen worden EASI creërenly gevolgd met behulp van een antilichaam congenische marker ^2,3. Terwijl krachtige Deze werkwijze heeft experimentele artefacten die met de niet-fysiologische frequentie van T-cellen met specificiteit voor een epitoop ^4,5. Bovendien kan dit systeem niet worden gebruikt om de functionele heterogeniteit van epitoop-specifieke T cel klonen te onderzoeken binnen een polyklonale populatie.

De ideale manier om adaptieve immuniteit bestuderen dienen onder directe detectie van epitoopspecifieke T-cellen van het endogene T-cel repertoire volgens een methode die TCR specificiteit onderscheidt uitsluitend door haar binding aan verwant peptide: MHC (pMHC) complexen. Het gebruik van pMHC tetrameren en flowcytometrie volbrengt deze ^6, maar is beperkt tot het opsporen van hoogfrequente populaties van epitoopspecifieke T-cellen aangetroffen volgende antigen geïnduceerde klonale expansie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze die het gebruik van pMHC tetrameren coördineert en magnesiumtic cel verrijkingscocktail technologie voor de detectie van extreem lage frequentie epitoopspecifieke T-cellen van muizen lymfoïde weefsels ^3,7 toestaat. Met deze techniek kan men volledig volgen gehele epitoopspecifieke populaties van endogene T-cellen in muizen in alle stadia van de immuunrespons.

Protocol

1. Cell Isolatie van lymfeweefsel

1. Voeg 1 ml ijskoud cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamycine, 2 mM L-glutamine, 55 mM 2-mercaptoethanol) of andere gelijkwaardige T-cel medium, een 60 mm kweekplaat die een klein stukje 100 um nylon gaas en plaats op ijs.
2. Euthanaseren muis.
3. Verwijder de milt en zoveel gemakkelijk toegankelijke lymfeknopen mogelijk. Deze omvatten ten minste de lies, oksel, brachiale, cervicale en mesenterische lymfklieren. Plaats ze bovenop de nylon mesh in de kweekschaal.
4. Met behulp van de platte bovenkant van een gesloten 1,5 ml microfugebuisje, het lymfoïde weefsel voorzichtig mash over de nylon mesh om lymfocyten te bevrijden. Voeg een 1 ml cEHAA en pipet op en neer om cellen werken in een suspensie. Breng de cellen door een ander stuk nylon mesh geplaatst over de top van een 15 ml polypropyleen centrifugebuis. Spoel de schaal en gaas met een 1 ml ijskoude cEHAA, pooling de volumes in dezelfde buis. Herhalen om een ​​uiteindelijke celsuspensie volume van 4 ml te bereiken.
5. Voeg koud sorter buffer (PBS + 2% FBS, 0,05% azide) tot een eindvolume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
6. Zuig de supernatant voorzichtig, zodat er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in Fc block (sorter buffer + 2.4G2 antilichaam) tot een volume gelijk aan ongeveer twee keer die van de pellet zelf. Bijvoorbeeld, de milt en lymfeknopen van een naïeve muis produceert gewoonlijk een cel pellet ongeveer 100 pl. In dit geval wordt 100 pl Fc blok om het volume op 200 pl brengen. Als er een grote mate van cel klonteren heeft plaatsgevonden, verwijder voorzichtig de cel klonteren op dit punt met een pipet tip.

2. Tetrameer Staining

1. Voeg PE-of APC-gemerkte pMHC tetrameer tot een eindconcentratie van 10 nM (of empirisch geoptimaliseerd concentratie).
2. Mix en incute 1 uur bij kamertemperatuur (of empirisch geoptimaliseerd tijd en temperatuur).
3. Voeg koud sorter buffer tot een volume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C. Bewaar monsters op ijs of bij 4 ° C vanaf nu.
4. Zuig de supernatant voorzichtig, zodat er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in sorter buffer tot een eindvolume van 200 ul. Voor dubbele tetrameer verrijking, resuspendeer tot een eindvolume van 150 ul.

3. Magnetische Verrijking

1. Voeg 50 ul van Miltenyi anti-PE of anti-APC microbolletjes. Voor dubbele tetrameer verrijking, voeg 50 ul van beide.
2. En incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
3. Voeg koud sorter buffer tot een volume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
4. Tijdens het wachten, het opzetten van een Miltenyi LS magnetische zuil op een MidiMACS of QuadroMACS magneet. Plaats een open 15 ml polypropyleen centrifugebuis eenrack direct onder de kolom.
5. 3 ml buffer sorter naar de top van de kolom, waardoor het afwateren in de 15 ml buis.
6. Plaats een nylon mesh 100 urn vierkante bovenop de kolom.
7. Wanneer cellen klaar spinnen zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml buffer sorter.
8. Breng de celsuspensie door de nylon mesh op de top van de kolom.
9. Wanneer de celsuspensie geheel is afgevoerd in de kolom, spoel de oorspronkelijke buis met een 3 ml buffer sorteerder en breng het buffer door de nylon mesh in de kolom, spoelen het gaas in het proces. Gooi de nylon mesh.
10. Wanneer de buffer volledig is afgevoerd naar de kolom toe nog 3 ml buffer sorter de kolom.
11. Herhaal stap 10 voor een totaal van 3 x 3 ml wasbeurten.
12. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats over een nieuwe 15 ml polypropyleen centrifugebuis.
13. Voeg 5 ml sorteerder buffer aan tHij kolom.
14. Plaats onmiddellijk de zuiger in de top van de kolom en in een vloeiende beweging, duw de zuiger helemaal naar beneden, waardoor de buffer van de kolom in de buis.
15. Centrifugeer de buizen die het geëlueerde gebonden fractie en de doorstroom ongebonden fractie gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
16. Zuig voorzichtig het supernatans van de gebonden fractie, waarbij er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in sorter buffer tot een eindvolume van 95 pi precies. Zuigen en resuspendeer de ongebonden fractie tot een eindvolume van 2 ml.

4. Flow Cytometry

1. Voor elke fractie, verwijderen 5 pl en aan 200 pl tellen kralen (ingesteld op een concentratie van 200.000 / ml in buffer sorter) in een 5 ml FACS buis. Terzijde bij 4 ° C voor analyse later. Om tijd te besparen, kan kralen vooraf worden verdeeld in fracties om gelabelde buizen voor de start van het experiment.
2. Bereid amaster mix van antilichamen tegen oppervlaktemerkers op de cellen (tabel 1) kleuring. Om tijd te besparen, kan deze worden verricht vóór de start van het experiment.
3. De gebonden fractie direct voeg een dosis van antilichaam cocktail de ~ 90 pi cellen in de buis. Als een analyse van de ongebonden fractie gewenst breng 90 pl van cellen aan een 5 ml FACS buis en voeg een dosis van antilichaam cocktail.
4. Het opzetten van een panel van een kleur vergoeding controles voor de flowcytometer. Voor elke fluorochroom te gebruiken mix 50 pi overgebleven ongebonden fractie cellen in een 5 ml FACS buis met 1 pi anti-CD4 antilichaam geconjugeerd aan de overeenkomstige fluorochroom. Vergeet niet om het opzetten van een ongekleurde controle ook.
5. Vortex en incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
6. Voeg 5 ml buffer sorter aan elke buis en centrifugeer 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
7. De gebonden fractie, zorgvuldig aspireren supernatant en resuspendeer de cellen in 200 ul sorter buffer. Breng de cellen in een 1,2 ml FACS microbuisjes. Spoel de buis met een andere 200 ul sorteerder buffer en het zwembad in dezelfde microbuisjes. Als celklonten zijn duidelijk zichtbaar, langs de cellen door een 50 pm filter.
8. Voor de ongebonden fractie en compensatie controles, schenk of aspireren het supernatans en resuspendeer in 2 ml sorter buffer.
9. Stel de flowcytometer met behulp van de single-kleurcompensatie controles. Selecteer zijwaartse verstrooiing-breedte (SSC-W) als extra parameter op te nemen.
10. Analyseer de gekleurde monsters met een reeks opeenvolgende integratie poorten CD4 + identificeren of CD8 + T-cellen zoals weergegeven in figuren 1 en 2. Voor gebonden fracties, verzamel zo veel cellen als mogelijk tot een maximum van 2.000.000 in totaal gebeurtenissen. Voor ongebonden fracties, het verzamelen van 1.000.000 totaal evenementen. Houd de overname tarief op of onder 3.000 gebeurtenissen per seconde.
11. Met dezelfde machine-instellingen, het analyseren van de tellen kraal monsters. Verzamel 10.000 in totaal gebeurtenissen.
12. Sla alle gegevens FCS-bestanden.

5. Data-analyse

1. Analyseer FCS gegevensbestanden voor de telling kraal monsters met behulp van FlowJo software. Plot voorwaartse verstrooiing door FITC en zet een hek aroung het tellen kralen (zie figuren 1 en 2). Bepaal het aantal tellen beads in elk monster. Aftrekken van het totale aantal verzamelde gebeurtenissen het aantal verzamelde cel gebeurtenissen.
2. Bereken het totale aantal cellen in elk monster met behulp van de vergelijkingen beschreven in box 1.
3. Analyseer FCS gegevensbestanden voor de gebrandschilderde gebonden en ongebonden fractie monsters. Stel een reeks opeenvolgende integratie poorten lymfoïde +, side scatter-breedte ^lo stortplaats-, CD3 +, CD4 + of CD8 +, tetrameer + T-cellen in elk monster zoals weergegeven in figuren 1 en 2. Identificeren
4. Vermenigvuldig het totale aantal cellen in het monster door de frequenties van elk van de opname poorten gebruikt om CD4 + definiëren tetrameer+ Of CD8 + cellen tetrameer + het totale aantal epitoop-specifieke T-cellen (Box 1) berekenen.

Resultaten

Figuur 1 geeft representatieve flowcytometrie stukken pMHCII tetrameer verrijkte milt en lymfeklieren monsters van naïeve muizen, terwijl Figuur 2 toont representatieve gegevens voor muizen geïmmuniseerd met de relevante peptide + CFA. Serial gating verwijdert autofluorescerende en andere ongewenste gebeurtenissen uit de analyse van CD4 + T-celpopulaties. De CD8 + T-celpopulatie dient als nuttige interne negatieve controle voor pMHCII tetrameer kleuring van CD4 + T-cellen. Merk op dat g...

Discussie

De pMHC tetrameer gebaseerde mobiele verrijking methode die door dit protocol is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van epitoop-specifieke T-cellen van endogene T-cel repertoire. Het gebruik van pMHC tetrameren maakt detectie van epitoopspecifieke T-cellen rechtstreeks gebaseerd op het vermogen van de TCR aan cognate pMHC liganden binden. De verrijking een niveau van gevoeligheid zodat uiterst zeldzame populaties van antigeen-specifieke T-cellen kunnen gedetecteerd worden uit repertoires van endogene T-cellen z...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens Vendor Catalogus nummer
PE of APC geconjugeerd pMHC tetrameer (of multimeer)	Gemaakt door onderzoeker, verkregen uit de NIH tetrameer kern, of gekocht uit commerciële bronnen
Anti-PE geconjugeerd magnetische microkorrels	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC geconjugeerde magnetische microkorrels	Miltenyi	130-090-855
LS magnetische columns	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS of QuadroMACS magneet	Miltenyi	130-042-302 of 130-090-976
Mobiele tellen kralen	Life Technologies	PCB-100