Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Yoray Sharon; Lina Alon; Sarah Glanz; Charlotte Servais; Neta Erez

doi:10.3791/4425

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

35.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4425

⸱

14 januari 2013

Yoray Sharon¹ , Lina Alon¹ , Sarah Glanz¹ , Charlotte Servais¹ , Neta Erez¹

¹Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel Aviv University

In dit artikel

Samenvatting

Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.

Samenvatting

Kankergeassocieerde fibroblasten (CAF) zijn de voornaamste celtype in de tumorstroma van vele soorten kanker, in het bijzonder borstkanker, en de prominente aanwezigheid wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose ^1,2. CAF zijn een geactiveerd subpopulatie stromale fibroblasten, waarvan vele drukken de myofibroblast marker α-SMA ^3. CAF afkomstig zijn van plaatselijke weefsel fibroblasten en van beenmerg afgeleide cellen gerekruteerd voor de ontwikkeling en tumor CAF fenotype onder invloed van de tumor micro ⁴ nemen. CAF werd aangetoond dat de tumor initiatie, groei en vooruitgang te bevorderen door middel van signalering dat bevordert tumorcelproliferatie, angiogenese en invasie ^5-8. We hebben aangetoond dat CAF tumor groei door bemiddeling tumor-bevorderende ontsteking, vanaf de eerste stadia preneoplastisch ^9. Ondanks de toenemende bewijs van de belangrijke rol CAF spelen in het faciliteren van de groei van tumoren,bestuderen CAF is een permanente uitdaging vanwege het ontbreken van CAF-specifieke markers en de enorme heterogeniteit van deze cellen met vele subtypen coëxisterende in de tumor micro-omgeving ^10. Bovendien onderzoekt fibroblasten in vitro belemmerd door het feit dat hun genexpressieprofiel vaak veranderd in weefselkweek ^11,12. Om dit probleem aan te pakken en onpartijdige genexpressie van fibroblasten van verse muis en menselijke weefsels mogelijk te maken, werd een methode ontwikkeld op basis van eerdere protocollen voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) ^13,14. Onze aanpak is gebaseerd op het benutten van PDGFRα als een oppervlak marker om fibroblasten te isoleren van verse muis en menselijk weefsel. PDGFRα is overvloedig uitgedrukt door zowel de normale fibroblasten en CAF ^9,15. Deze methode maakt isolatie van zuivere populaties van normale fibroblasten en CAF, inclusief maar niet beperkt tot α-SMA + geactiveerd myofibroblasten. Fibroblasten geïsoleerd kunnen danvoor karakterisering en vergelijking van de ontwikkeling van genexpressie die optreedt in CAF tijdens tumorigenese. Sterker nog, wij en anderen gemeld expressie profilering van fibroblasten geïsoleerd door celsortering ^16. Dit protocol werd met succes uitgevoerd te isoleren en hoogverrijkt populaties van fibroblasten profiel van de huid, borstklier, pancreas en longen. Bovendien maakt onze methode ook kweken van cellen gesorteerd, om functionele experimenten en verontreiniging door tumorcellen, die vaak een groot obstakel wanneer het proberen om cultuur CAF voorkomen.

Protocol

1. Ontleden uier of huidweefsel van muizen

Voor het ontleden van de gewenste weefsel van muizen, de voorbereiding van de volgende leveringen en reagentia:
Benodigdheden:
- Chirurgie gereedschap (gewassen met wasmiddel en vervolgens ondergedompeld in 70% ethanol).
- Styrofoam oppervlak de muis rusten tijdens dissectie.
- Pins of naalden aan muizen te houden tijdens dissectie.
- Glazen pot met deksel voor de spijsvertering, met daarin magnetische roerstaaf (geautoclaveerd).
- Waterbad bij 37 ° C, met een dompelpomp magnetische roerder en voldoende water te dompelen de spijsvertering pot, terwijl rust op de roerplaat.
Reagentia:
- FACS buffer I: (4 ° C): Dulbecco's fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing CMF (Calcium Magnesium Free) + 0,5% BSA
- Collagenaseoplossing (die onmiddellijk voor gebruik):
  0,05 g Collagenase II
  0,05 g Collagenase IV
  0,01 g deoxyribonuclease
  20ml FACS buffer I. houden collagenaseoplossing tot gebruik op ijs.
- PharmLyse (Ammonium Chloride lyseringsreagens).
- FACS buffer II: Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing CMF + 1% FCS.
Dissectie van de borstklieren (zie ook ^17).
- Euthanaseren vrouwelijke muizen met behulp van kooldioxide (CO ₂₎ inademing.
- Op een piepschuim ondergrond, plaatst u de muis op zijn rug en speld vast alle vier de ledematen met 25 gauge naalden (Figuur 1A). Royaal Spuit de muis met 70% ethanol.
- Met behulp van een tang, trek de buikhuid bij de middellijn en maak een kleine incisie met een scherpe schaar.
- Vanaf de incisie, de huid snijden tot aan de nek van het dier terwijl het vermijden aanprikken van de buik of borstkas holten.
- Snijd de huid op de achterpoten van de middellijn incisie naar het been, resulterend in een "Y-vorm".
- Trek de huid van de muis lichaam en vastpinnen, het blootstellen vande borstklieren aan de onderkant van de huid (Figuur 1B).
- Gebruik Q-tips om voorzichtig melkklieren te scheiden van de huid tijdens het snijden bindweefsel met kleine scherpe schaar om de borstklier te scheiden in de richting van de rug van de muis.
- De abdominale klieren (# 4, 5) zijn het beste voor dit protocol. U kunt ook gebruik maken van de 2 ^e borstklier, maar houd in gedachten dat deze klieren anatomisch bevinden zich in de nabijheid van de borstspier, die moeilijker te scheiden, wat resulteert in cellen van gemengde weefsels oorsprong.
- Opmerking: Wanneer ontleden tumorweefsel, is het raadzaam om necrotische gebieden te verwijderen.
Dissectie van huidweefsel: De eenvoudigste manier om de huid weefsel te verkrijgen, zonder dat te maken met ontharing is het gebruik van de muis oren. Als een grotere hoeveelheid weefsel nodig is, kunt u afscheren haar van de muis torso en ontleden huid.
- Euthanaseren muizen met _CO2 inhalatie.
- Met behulp van een scherpe schaar, sneed beide oren en plaats direct bij de spijsvertering pot met een klein volume (~ 0,5 ml) van PBS op ijs.

2. Voorbereiding van borstklier / huid enkele celsuspensie

Plaats melkklieren / achtergrond in vertering pot met een klein volume PBS op ijs. Als weefsel is bloederig wassen x2 met PBS, en dan gooi overtollige PBS.
Hak grondig met gebogen schaar.
Voeg 20 ml collagenase oplossing (let op: dit bedrag van collagenase oplossing zal ongeveer 5 g van mammaire of tumorweefsel en oren efficiënt distantiëren van maximaal 15 muizen).
Plaats onmiddellijk roerplaat in 37 ° C waterbad en incubeer gedurende 15 min onder roeren bij gemiddelde snelheid.

Opmerking: optimale incubatietijd kan variëren als het verteren van andere weefsels.

Om de reactie te stoppen, voeg 30 ml koude DMEM + 10% FCS.
Zeef het weefsel / media mengsel througha 70 urn celzeef bovenop een 50 ml conische buis.
Centrifugeer de conische buis gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C.

3. Rode bloedcellen Lysis

Let op: deze stap is niet nodig als muizen waren hart-perfusie met PBS voordat ze werden geofferd.

Zuig de supernatant met een glazen pipet aan vacuum, zonder de celkorrel.
RBC, resuspendeer celpellet lyseren in 10 ml PharmLyse oplossing en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
Neutraliseer de PharmLyse oplossing door toevoeging van ongeveer 40 ml FACS-buffer I.
Draai de conische buis met cellen gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C.
Zuig het supernatant.

4. Het blokkeren van endogene Fc

Optioneel: aantal cellen naar de juiste volume voor de volgende stappen te bepalen.
Resuspendeer cellen in 1-3 ml FACS buffer I (afhankelijk on aantal cellen, en de hoeveelheid antistoffen die u wilt gebruiken).
Voeg FcBlock (anti-muis CD16/CD32) tot 1:50 verdunning (10 ug / ml) te bereiken en op ijs geïncubeerd gedurende 10-20.
Geen behoefte te wassen FcBlock.

5. Kleuring

Neem 100 ul aliquots op eppendorf buizen worden gebruikt als een niet-gekleurde bediening met een kleurinstellingen (volgens het aantal gebruikte fluorescente antilichamen).
Om label fibroblasten: voeg anti-PDGFRα (direct geconjugeerd aan fluorofoor) met een verdunning van 1:50 (10 ug / ml).
Om andere celpopulaties (bijv. immuuncellen, macrofagen, endotheelcellen, enz.) te labelen: voeg de juiste fluorescent geconjugeerde antilichamen aan de oppervlakte markers, een 1:50 verdunning.

Opmerking: hoewel PDGFRα is een robuuste marker voor fibroblasten, wordt aanbevolen antilichamen omvatten immuuncellen en epitheelcellen om eventuele dubbele positieve sluitenpopulaties en zo de zuiverheid van geïsoleerde fibroblasten.

Voeg 2 pi van elk antilichaam aan elk van de kleur control eppendorf buizen.
Incubeer cellen met antilichamen gedurende 1 uur op ijs in het donker.
Te wassen: vul buizen met FACS-buffer I en draai gedurende 5 minuten bij 450 xg bij 4 ° C.
Zuig supernatant, resuspendeer cellen in FACS buffer I tot een concentratie van ongeveer 2 x 10 ⁶ cellen / ml, of welke concentratie meest geschikt voor het sorteren met de beschikbare FACS sorter.

Optioneel: Cellen worden opnieuw gesuspendeerd in FACS buffer II gedurende de sortering. Dit kan de levensvatbaarheid van de cellen. Echter kan de blootstelling aan factoren in serum van invloed genexpressie die moet worden getest, en in aanmerking genomen.

Overdracht gelabelde cellen in FACS buisjes met filter boven: filter cellen in de buizen naar cel klonten te voorkomen.
Om dode cellen te sluiten, voegt 7AAD (0,5 ug / ml) of Propidium jodide (PI) monsters (met uitzondering van de niet-gekleurde controle).

Opmerking: Om te voorkomen dat het verspillen van cellen, kunt u 7AAD/PI toevoegen aan de niet-gekleurde monster na het opnemen in de FACS, en opnieuw als 7AAD controlegroep met uitsluitend gebruiken.

Bewaar monsters op ijs tijdens het analyseren.

6. Isolatie van cellen door FACS

(Let op: dit deel van het protocol vereist voorkennis in de exploitatie van een FACS sorter, bijvoorbeeld BD FACS AriaII, of de hulp van een vakman).

Met behulp van de FACS sorter software (BD FACSDiva), voor te bereiden passende analyse percelen voorwaartse verstrooiing (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC), 7AAD, FITC, PE en andere fluorofoor gebruikt om label-cellen (Figuur 2) te analyseren.
Voor het laden van elk monster voor de cel sorteerder, vortex kort aan cellen opnieuw in suspensie.
Begin met de ongekleurde monster analyseren om de gating gesteld aan de totale celpopulatie te gate van cell puin, en autofluorescentie of achtergrondkleuring bepalen.
Analyseer ongekleurde monster + 7AAD bepalen en gate de populatie van levende cellen van de totale celpopulatie.
Analyseer elke afzonderlijke kleur controle om vast te stellen en te kalibreren parameters zoals compensatie.
Analyseer de gekleurde monster om de positie van poorten te definiëren voor het sorteren.
Zodra de parameters en poorten voor de gewenste celpopulaties zijn ingesteld, begint het sorteren van de gelabelde celpopulaties in Eppendorf buizen of 15 ml conische buizen met kweekmedium of RNA lysis buffer (zoals RLT buffer of Trizol).

Opmerking: Als het sorteren van een groot aantal cellen, wordt het afgeraden om direct te sorteren in RNA lysis buffer, de grote hoeveelheid mantelvloeistof bij de cellen de lysisbuffer verdunnen en verminderen de opbrengst.

Spin Cellen naar beneden direct na het sorteren is voltooid, en de overdracht naar vers medium of RNA lysis buffer, deafhankelijk van het doel van uw experiment.
Indien het sorteren met het oog op de cultuur geïsoleerde cellen, uit te voeren steriel soort. Voor beter herstel van cellen met fenolrood vrij DMEM + 5% FCS plaats van FACS buffer II en verzamelen cellen in kweekmedium met 20% FCS.
Als het kweken gesorteerd fibroblasten, alwaysplate op collageen gecoate platen en nooit rechtstreeks op kunststof, omdat dit resulteert in activatie van fibroblasten die leidt tot veranderingen in hun genexpressie.