Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

Summary

Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.

Abstract

Functionele inactivatie van genexpressie in zoogdiercellen is cruciaal voor de studie van de bijdrage van een eiwit van belang verschillende trajecten ^1,2. Echter afhankelijk knockdown van genexpressie nodig in gevallen waarin constitutieve knockdown wordt niet getolereerd door de cellen gedurende lange tijd ^3-5. Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van cellijnen mogelijk afhankelijk knockdown van subeenheden van de ACF chromatine remodeling factor. Deze cellijnen vergemakkelijken het bepalen van de bijdrage van ACF inductie van celdood door het adenovirus E4orf4 eiwit ^6. Sequenties die coderen short hairpin RNAs voor de Acf1 en SNF2h subeenheden van het ACF chromatine hermodellering factor werden naast een doxycycline-induceerbare promoter in een plasmide dat ook een gen voor neomycine resistentie gen gekloneerd. Neomycine-resistente cel klonen werden geselecteerd in de aanwezigheid van G418 en geïsoleerd. De resulterende cellijnen werden geïnduceerd doordoxycycline behandeling en na Acf1 of SNF2h expressie werden verlaagd, werden de cellen getransfecteerd met een plasmide coderend E4orf4 of een lege vector. Het specifieke effect van de shRNA constructen bevestigen werden Acf1 of SNF2h eiwitniveaus hersteld WT niveaus door cotransfectie met een plasmide dat Acf1 of SNF2h die tegen de shRNA die door invoering van stille mutaties. Het vermogen van E4orf4 om celdood te induceren in de verschillende monsters werd bepaald door een assay DAPI, waarbij de frequentie van verschijnen van kernen met apoptotische morfologie in de getransfecteerde celpopulatie werd gemeten ^7-9.

De hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor het bepalen van de functionele bijdrage van diverse eiwitten inductie van celdood door hun eiwit partners in gevallen waarin constitutieve knockdown cel kan dodelijk zijn.

Protocol

1. Generatie Induceerbare cellijnen

1. Voorafgaand aan het experiment moet men vinden de minimale concentratie van het geneesmiddel G418 waarbij alle cellen gebruikt voor het bereiden van de gewenste cellijnen doodt. Daartoe plaat de cellen van keuze in verschillende dubbele platen bij 70% confluentie in het medium dat wordt gebruikt tijdens het experiment en voeg toenemende concentraties van G418 (0-1.000 ug per ml). Toezicht houden op de cellen dagelijks aan de minimale G418 concentratie die de cellen doodt efficiënt te bepalen. Celdood wordt waargenomen binnen 3-7 dagen.
2. Voorafgaand aan van cellijnen wordt aanbevolen om door transiënte transfecti....

Discussion

Knockdown van genexpressie is een belangrijke benadering voor het onderzoek naar de bijdrage van een eiwit regulerende pathways. Sinds constitutieve knock-down van de expressie van essentiële genen een negatieve invloed op de celproliferatie, kunnen hun studie nodig hebben, hetzij van voorbijgaande aard introductie van siRNA's of de toepassing van een stabiele voorwaardelijke knockdown systemen. Genereren van stabiele cellijnen met het vermogen tot drug-geïnduceerde expressie van shRNAs hier beschreven, een voordeel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Hoog glucose DMEM	Gibco	41965
Tet goedgekeurd systeem FBS	Clontech	631106
L-glutamine	Gibco	25030
Pen Strep	Gibco	15140
0,25% trypsine-EDTA	Gibco	25200
T-rex-293-cellen	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
blasticidine	InvitRogen	R210-01
pSuperior.neo + GFP plasmide	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus transfectie	Honderdenéén-veertig
doxycycline	Sigma	D9891
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01