Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

Summary

Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.

Abstract

Functionele inactivatie van genexpressie in zoogdiercellen is cruciaal voor de studie van de bijdrage van een eiwit van belang verschillende trajecten ^1,2. Echter afhankelijk knockdown van genexpressie nodig in gevallen waarin constitutieve knockdown wordt niet getolereerd door de cellen gedurende lange tijd ^3-5. Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van cellijnen mogelijk afhankelijk knockdown van subeenheden van de ACF chromatine remodeling factor. Deze cellijnen vergemakkelijken het bepalen van de bijdrage van ACF inductie van celdood door het adenovirus E4orf4 eiwit ^6. Sequenties die coderen short hairpin RNAs voor de Acf1 en SNF2h subeenheden van het ACF chromatine hermodellering factor werden naast een doxycycline-induceerbare promoter in een plasmide dat ook een gen voor neomycine resistentie gen gekloneerd. Neomycine-resistente cel klonen werden geselecteerd in de aanwezigheid van G418 en geïsoleerd. De resulterende cellijnen werden geïnduceerd doordoxycycline behandeling en na Acf1 of SNF2h expressie werden verlaagd, werden de cellen getransfecteerd met een plasmide coderend E4orf4 of een lege vector. Het specifieke effect van de shRNA constructen bevestigen werden Acf1 of SNF2h eiwitniveaus hersteld WT niveaus door cotransfectie met een plasmide dat Acf1 of SNF2h die tegen de shRNA die door invoering van stille mutaties. Het vermogen van E4orf4 om celdood te induceren in de verschillende monsters werd bepaald door een assay DAPI, waarbij de frequentie van verschijnen van kernen met apoptotische morfologie in de getransfecteerde celpopulatie werd gemeten ^7-9.

De hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor het bepalen van de functionele bijdrage van diverse eiwitten inductie van celdood door hun eiwit partners in gevallen waarin constitutieve knockdown cel kan dodelijk zijn.

Protocol

1. Generatie Induceerbare cellijnen

1. Voorafgaand aan het experiment moet men vinden de minimale concentratie van het geneesmiddel G418 waarbij alle cellen gebruikt voor het bereiden van de gewenste cellijnen doodt. Daartoe plaat de cellen van keuze in verschillende dubbele platen bij 70% confluentie in het medium dat wordt gebruikt tijdens het experiment en voeg toenemende concentraties van G418 (0-1.000 ug per ml). Toezicht houden op de cellen dagelijks aan de minimale G418 concentratie die de cellen doodt efficiënt te bepalen. Celdood wordt waargenomen binnen 3-7 dagen.
2. Voorafgaand aan van cellijnen wordt aanbevolen om door transiënte transfectie assays dat de plasmide dat de shRNA kan enigszins drukken expressie van het gen onder studie. Dit kan in elke cellijn die efficiënt kunnen worden getransfecteerd.
3. Plaat T-Rex-293 cellen in een dichtheid van ongeveer 5x10 cellen per ⁶ cm plaat 10 in 8 ml DMEM medium (dat 10% Tet systam goedgekeurde FBS, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden per ml penicilline en 0,1 mg per ml streptomycine, 5 ug per ml blasticidine). Incubeer de platen bij 37 ° C, _5% CO2.
4. De volgende dag, wijzigen medium tot 8 ml vers medium vóór transfectie.
5. Transfecteren van de cellen met 10 ug pSuperior.neo + GFP plasmide (Figuur 1) codeert Acf1 of SNF2h shRNA aangedreven door een tetracycline-induceerbare promoter H1, alsmede de neomycine resistentie gen gefuseerd aan GFP en aangedreven door een constitutieve PGK promoter. Voeg de DNA tot 500 ui 150 mM NaCl. Voeg jetPIE reagens een andere hoeveelheid van 500 ui 150 mM NaCl bij 2 pi per pg DNA. Voeg jetPIE oplossing van het DNA en vortex grondig. Incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Voorzichtig pipetteren DNA complexen op de 10 cm platen die 70-80% confluente cellen. De platen terug naar de incubator.
6. De volgende dag vervangen medium met een selectief medium (DMEM medium alsbeschreven die een extra 500 ug per ml G418).
7. Voor de komende twee weken toezicht op de cellen en vervang het selectieve medium met een vergelijkbare vers medium om de 3-4 dagen totdat kolonies verschijnen en kunnen worden gevisualiseerd zonder een microscoop.
8. Voorafgaand aan isolatie van kolonies bereiden 24-well platen met selectief medium.
9. Identificeer kolonies op het oog, en markeer de plaats aan de onderzijde van de plaat met een gekleurde markering. Controleer onder de microscoop dat de kolonies goed worden gescheiden.
10. In de steriele kap, zuigen het medium van de plaat voorzichtig afspoelen met warm PBS en goed alle resterende vloeistof te zuigen. Voeg 3 pl 0,25% trypsine / EDTA een kolonie op de plaat. Herhaaldelijk kuvet met trypsine totdat de cellen los te maken en toe te voegen aan een van de putjes in de plaat met 24 putjes. Herhaal dit voor verschillende andere kolonies op de plaat.
11. De cellen groeien bij 37 ° C, _5% CO2 totdat zij vullen de put. Dan splitsen de cellen uitelk van de oorspronkelijke kolonies in drie putjes, elk in een aparte 12-well plaat en incubeer overnacht.
12. Op de volgende dag vervangen medium in een plaat met medium dat 1 ug per ml doxycycline van een voorraadoplossing bereid in tweemaal gedestilleerd water (1-5 mg per ml). Vervang het medium in een controle plaat met medium zonder doxycycline. Incubeer de cellen gedurende 72 uur bij 37 ° C, _5% CO2.
13. Oogst cellen van een behandeld en een onbehandelde putje van elke cel kloon voor de bereiding van eiwitextracten en Western blot analyse van de doeltreffendheid van Acf1 of SNF2h knockdown bepalen. Gebruik antilichamen tegen Acf1 of SNF2h alsook antilichamen tegen alfa-tubuline, die als loading controle. Met de cellen goed in het derde, onbehandeld, voor uitbreiding van geselecteerde celklonen waarin doxycycline aanvulling tot ten minste 50% verlaging van het niveau van het eiwit onder studie. Freeze aliquots van deze cellen in 90% FBS, 10% DMSO voor verder gebruik.

2. Inductie van Knockdown en transfectie

1. Cellaag in het selectieve medium in 10 cm platen. Voeg doxycycline met 1 ug per ml aan de helft van de platen en incubeer bij 37 ° C, _5% CO2 gedurende 48-72 uur (zie figuur 4).
2. Na 48-72 uur, trypsinize de cellen uit elke groep cellen tellen, en plaat 1.5x10 ⁶ cellen per 6 cm plaat in hetzelfde medium met of zonder doxycycline. Incubeer de cellen bij 37 ° C, _5% CO2 gedurende de nacht. Plan zodat elke groep platen punt 2.1 zullen de cellen gedurende twaalf 6 cm platen, waaronder twee duplicaten voor de DAPI assay voor elk punt als een plaat voor Western blot analyse van elk monster (zie figuur 4).
3. De volgende dag transfecteren de cellen in 6 cm platen met de volgende combinaties van Plasmiden: 1 ug plasmide of een lege dezelfde hoeveelheid plasmide coderend E4orf4, samen met 4 ug van een vectorexpressie Acf1-GFP of GFP-SNF2h gemaakt tegen de shRNA in de celklonen door het inbrengen van stille mutaties of 3 ug van de overeenkomstige lege vector en 1 ug plasmide dat GFP (Figuur 4). Gebruik de jetPIE reagens zoals hierboven beschreven (10 pl per 5 ug DNA) de transfectie mix bereiden. Voor elk monster, een transfectiemengsel drie platen.
4. Na 15 min incubatie van het DNA jetPIE reagens bij kamertemperatuur voorzichtig pipetteren gelijke hoeveelheden DNA complexen uit elke transfectie mix op drie 6 cm platen en incubeer bij 37 ° C, _5% CO2 gedurende de nacht.

3. DAPI Assay in getransfecteerde cellen

1. De volgende dag, extraheren van eiwitten uit een plaat per monster Western blot analyse om te bepalen of die Acf1 SNF2h hebben efficiënt neergeslagen en E4orf4 werd ook uitgedrukt in de verschillende monsters.
2. Zuig het medium van de platen voor de DAPIassay, voorzichtig wassen van de platen met PBS en voeg 1 ml van 4% paraformaldehyde in PBS bereid om de cellen te dekken. Bereiding van de oplossing paraformaldehyde en behandeling van de cellen met deze chemische stof worden uitgevoerd in een chemische afzuigkap. Incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur zonder schudden.
3. Zuig het paraformaldehyde en was driemaal met PBS, schommelen bij kamertemperatuur gedurende 5 min per keer. Voeg 80% ethanol bewaard bij -20 ° C en incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur. De platen kunnen worden gehouden ethanol bij -20 ° C gedurende meerdere dagen zolang ze goed zijn afgedicht om verdamping ethanol en drogen te voorkomen.
4. Zuig het ethanol en tweemaal de cellen met PBS gewassen en eenmaal met PBS-BT (PBS dat 0,5% BSA en 0,05% Tween-20), schommelen bij kamertemperatuur gedurende 5 min per keer.
5. Om niet-specifieke antilichaambinding voorkomen blokkeren de cellen in 1 ml PBS-BT buffer bevattende 10% geitenserum gedurende 20 min terwijl schommelen bij kamertemperatuur. Was daarna thij cellen tweemaal in PBS-BT, 5 min elke wasbeurt.
6. Incubeer de cellen met het primaire antilichaam (een E4orf4-specifiek antilichaam in ons geval) in 1 ml PBS-BT gedurende 1 uur terwijl schommelen bij kamertemperatuur. Vervolgens tweemaal wassen in PBS-BT en eenmaal in PBS met 0,1% BSA, 5 min elke wasbeurt.
7. Incubeer de cellen in 1 ml van PBS-0,1% BSA bevattende geschikte secundaire fluorescentie-gemerkte antilichaam en 0,5 pg per ml eindconcentratie van DAPI gedurende 40 minuten terwijl schommelen bij kamertemperatuur in het donker. Daarna wassen met PBS gedurende 5 minuten droge en door afzuiging en houden de platen ondersteboven gedurende een extra uur overnacht volledige droging te bereiken. Monteer dekglaasjes op de cellen, met Fluoromount-G oplossing. Houden platen bij 4 ° C in het donker tot gebruik met de apoptotische kernen te tellen.
8. Vraag een collega om de verschillende platen te identificeren door nieuw nummer, het tellen apoptotische kernen in de verschillende monsters kan op een objectieve wijze.
9. Visualiseer de cellen onder een upright fluorescerende microscoop bij een vergroting van 400X (in lucht) of 630x (in immersie olie). Identificeer getransfecteerde cellen die gekleurd voor de verschillende eiwitten die in elk monster, en tel het aantal gecondenseerde of gefragmenteerde kernen gevisualiseerd door DAPI kleuring in de getransfecteerde celpopulatie. Bewaking van meerdere velden en tellen in totaal ten minste 200 getransfecteerde cellen.
10. Bereken het percentage kernen met apoptotische morfologie binnen de getransfecteerde celpopulatie. Herhaal het experiment met duplicaten tot 2-3 maal de statistische significantie van verschillen tussen de verschillende monsters.

4. Representatieve resultaten

De efficiëntie van het verkrijgen van kolonies waarin voorwaardelijke knockdown van genexpressie is succesvol is variabel, afhankelijk van het betrokken gen. In onze handen, we 7 succesvolle kolonies verkregen van de 12 getest op Acf1 en 6 van de 18 voor SNF2h. Figuur 2 shdankt een vertegenwoordiger plaat van geselecteerde cel klonen (Figuur 2A) en een enkele kolonie (Figuur 2B). Figuur 3 toont een representatief blot bereid met eiwitten uit cellen van verschillende klonen gegroeid in de aanwezigheid of afwezigheid van doxycycline gedurende 72 uur. De blot werd gekleurd met antilichamen tegen SNF2h en alfa-tubuline, die als loading controle. Twee van de klonen (nummer 4 en 5) liet een sterke daling van de SNF2h niveaus op doxycycline inductie. Er zij opgemerkt dat, hoewel pSuperior.neo + GFP plasmide (Figuur 1) gebruikt voor het genereren van cellijnen codeert voor een neo-GFP fusie-eiwit, de groene fluorescentie in de stabiele cellijnen was zeer laag en expressie van andere GFP fusie-eiwitten tijdelijk geïntroduceerd in deze cellen kan gemakkelijk worden gedetecteerd boven de achtergrond groene fluorescentie.

Een schematische weergave van de experimenten die in de cel klonen meaof het effect van Acf1 of SNF2h knockdown on E4orf4 geïnduceerde celdood wordt getoond in Fig. 4. De benodigde tijd voor het uitschakelen van genexpressie door doxycycline behandeling kan variëren afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit waarvan de spiegels te verlagen. Voor Acf1 en SNF2h werd een 72 uur behandeling voor efficiënte knockdown op eiwitniveau.

Figuur 5 toont een voorbeeld van cellen die GFP en E4orf4 en celdood ondergaan gemanifesteerd door het verschijnen van DAPI-gekleurde kernen met een gecondenseerde of gefragmenteerde morfologie. Figuur 6 toont de resultaten van een representatief experiment blijkt dat doxycycline geïnduceerde Acf1 knockdown tot een toename E4orf4 gestimuleerde celdood (Figuur 6A). Deze toename werd niet veroorzaakt door een toename E4orf4 niveaus (Figuur 6B). Voorts herstel van Acf1 de doxycycline geïnduceerde cellen verminderde de toename E4orf4 toxiciteit voor de niveaus waargenomen in geïnduceerde cellen (Figuur 6).

Figuur 1. Kaart van pSuperior.neo + GFP plasmide. De kaart toont het tetracycline-induceerbare promoter H1 een shRNA expressie en de PGK promoter expressie van een neo-GFP fusie-eiwit. De kaart werd aangepast van de OligoEngine pSuperior handleiding.

Figuur 2. Identificatie van neomycine-resistente kolonies. Afbeeldingen van een plaat bevattende kolonies (A) en een enkele kolonie (B) getoond. De kolonies werden verkregen door de cellen gedurende 14 dagen in een selectief medium dat neomycine.

ys ">
Figuur 3. Onderzoek van knockdown efficiency in geselecteerde kolonies. Cellen van verschillende kolonies geselecteerd in aanwezigheid van neomycine werden uitgeplaat in putjes in duplo. Een putje van elk monster werd geïnduceerd door doxycycline (+) en een putje werd onbehandeld (-). Eiwitten werden geëxtraheerd 72 uur na inductie en gechromatografeerd op SDS-PAGE. De Western blot werd achtereenvolgens gekleurd met antilichamen tegen SNF2h en alfa-tubuline (die als lading controle) en toont SNF2h niveaus in geïnduceerde en controle cellen.

Figuur 4. Het plannen van een typische knockdown-DAPI assay experiment. Opeenvolgende stappen van de proefneming zijn weergegeven, zoals doxycycline behandeling Acf1 of SNF2h knockdown een transfectie te Acf1 of SNF2h expressie herstellen of een emp voeren verwezenlijkenty vector en E4orf4 of zijn overeenkomstige lege vector introduceren in de cellen en analyse van de resultaten. Doxycycline-behandelde platen zijn in rood weergegeven (Dox) en controle platen zijn blauw gemarkeerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. Detectie van E4orf4 geïnduceerde celdood door DAPI assay. Cellen die de verschillende behandelingen beschreven in figuur 4 ondergingen werden gefixeerd en gekleurd met E4orf4-specifieke antilichamen en DAPI de kernen van getransfecteerde cellen te visualiseren. Deze specifieke beeld werd genomen uit een monster dat E4orf4 en de controle GFP eiwit. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Samengevoegde beelden. De witte pijlen merk GFP-en E4orf4-getransfecteerde cellen met kernen met apoptotische morfologie. Rode pijlenmarkeer kernen met onregelmatige vormen die niet gerekend apoptotische kernen. Sterretjes merk mitotische kernen of kernen die net zijn verdeeld.

Figuur 6. Acf1 knockdown verbetert E4orf4-geïnduceerde celdood. (A) Cellen van de T-Rex-293 afgeleide cellijn Acf1-shRNA van een tetracycline-induceerbare promoter werden geïnduceerd met doxycycline (Dox +) of onbehandeld (-Dox). Drie dagen later werden de cellen getransfecteerd met plasmiden die E4orf4 (+ E4orf4) of een lege vector (-E4orf4) met een lege vector of een plasmide dat GFP-gelabeld Acf1, dat tegen de shRNA die door de invoering van stille mutaties. De cellen werden vierentwintig uur na transfectie en gekleurd met antilichamen tegen E4orf4 met DAPI. Inductie van celdood werd gemeten met de hierboven beschreven assay DAPI en het percentage of getransfecteerde cellen met gecondenseerde of gefragmenteerde kernen werd bepaald. Een representatief experiment met drie replicaten getoond en foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. (B) Cellen uit parallelle platen werden geoogst voor Western blot analyse. De blot werd gekleurd met antilichamen tegen E4orf4, GFP en Acf1. De endogene Acf1 en Acf1-GFP worden in twee afzonderlijke panelen.

Discussion

Knockdown van genexpressie is een belangrijke benadering voor het onderzoek naar de bijdrage van een eiwit regulerende pathways. Sinds constitutieve knock-down van de expressie van essentiële genen een negatieve invloed op de celproliferatie, kunnen hun studie nodig hebben, hetzij van voorbijgaande aard introductie van siRNA's of de toepassing van een stabiele voorwaardelijke knockdown systemen. Genereren van stabiele cellijnen met het vermogen tot drug-geïnduceerde expressie van shRNAs hier beschreven, een voordeel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Hoog glucose DMEM	Gibco	41965
Tet goedgekeurd systeem FBS	Clontech	631106
L-glutamine	Gibco	25030
Pen Strep	Gibco	15140
0,25% trypsine-EDTA	Gibco	25200
T-rex-293-cellen	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
blasticidine	InvitRogen	R210-01
pSuperior.neo + GFP plasmide	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus transfectie	Honderdenéén-veertig
doxycycline	Sigma	D9891
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01