Hier beschrijven we een moleculaire uitlezing van langdurige geur aanpassing Caenorhabditis elegans. De Protein Kinase G, EGL-4 is nodig voor een stabiele aanpassingsmaatregelen in de primaire sensorische neuron pair genoemd AWC. Tijdens langdurige geur blootstelling EGL-4 translokeert van het cytosol naar kern van de AWC.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tijdens langdurige stimulatie meeste sensorische neuronen zullen hun reactie van afnemende gevoeligheid van het signaal. De aanpassing reactie helpt vorm aandacht en ook beschermt de cellen tegen over-stimulatie. Aanpassing in de olfactorische circuit van C. elegans werd eerst beschreven door Colbert en Bargmann 1,2. Hier de auteurs gedefinieerde parameters van de olfactorische aanpassing paradigma, dat ze vroeger een genetische screen ontwerpen te isoleren mutanten gebrekkig in hun vermogen tot aanpassing aan vluchtige geuren waargenomen door de cellen Amphid Wing type C (AWC) sensorische neuronen. Bij wildtype C. elegans dieren blootgesteld aan een aantrekkelijke AWC-waargenomen geur 3 voor 30 min zij hun gevoeligheid aan de geur en worden dan genegeerd aanpassing geur in een assay voor chemotaxis gedrag ~ 1 uur. Bij wildtype C. elegans dieren blootgesteld aan een aantrekkelijke AWC-waargenomen geur voor ~ 1 uur zij dan de aanpassing geur ac negerenhemotaxis gedrag assay voor ~ 3 uur. Deze twee fasen van olfactorische aanpassing C. elegans werden beschreven als korte termijn olfactorische aanpassing (geïnduceerd na 30 min geur blootstelling), en op lange termijn olfactorische aanpassing (geïnduceerd na 60 min geur blootstelling). Later werk van L'Etoile et al.., 4 ontdekt een Proteïne Kinase G (PKG) genoemd EGL-4 die nodig is voor zowel de korte termijn en lange termijn olfactorische aanpassing in AWC neuronen. De EGL-4 eiwit een nucleaire lokalisatie sequentie die nodig is voor langdurige geur aanpassingsmaatregelen maar overbodig voor kort olfactorische aanpassingsmaatregelen in de AWC 4. Door tagging EGL-4 met een groen fluorescerend eiwit, kon de lokalisatie van EGL-4 in de AWC tijdens langdurige geur blootstelling visualiseren. Met deze volledig functioneel GFP-gemerkte EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecuul hebben we een moleculaire uitlezing van langdurige geur aanpassing in de AWC 5 ontwikkelen. Gebruik van deze molecular uitlezing van olfactorische aanpassing hebben we in staat geweest om zowel vooruit als achteruit genetische screens uit te voeren om mutante dieren die defect subcellulaire lokalisatie patronen van GFP :: EGL-4 exposeren in de AWC 6,7 identificeren. Hier beschrijven we: 1) de constructie van GFP :: EGL-4 tot expressie dieren 2) het protocol voor het kweken van dieren voor langdurige geur geïnduceerde kerntranslocatie assays en 3) het scoren van de langdurige geur geïnduceerde nucleaire translocatie evenement en herstel (her-sensibilisatie) van de nucleaire GFP :: EGL-4 staat.
Protocol
1. Bouw van GFP Tagged EGL-4 tot expressie Dieren
- Kloon de translationele fusie GFP :: EGL-4 onder de promotor voor het odr-3-gen (gebruik 2678 bp stroomopwaarts van het startcodon): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. De ODR-3 promoter expressie in de amphid neuron paren: AWA, AWB, AWC, en zwak in ASH.
- Injecteer het plasmide (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 in wildtype (N2) dieren bij 50 ng / ul met de co-injectie markers met behulp van standaard kiembaan transformatie technieken 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / pl) en (p) odr-1 :: DsRed 10 (25 ng / pl). De ODR-1 promoter expressie in de AWC en AWB amphid neuron paren, en de OFM-1 promoter expressie in de coelomocytes.
- Onderwerp De transgene dieren die de extrachromosomaal arrays beschreven in stap 1.2 tot de Ultra Violet (UV) / trimethylpsoraleen (TMP) integratie-protocol11.
- Bleach synchroniseren van de dieren 12 en cultiveren ze op Nematode Groei Media (NGM) platen met OP50 E. coli de L4 stadium. Was L4 dieren af NGM platen met M9 buffer om OP50 E. verwijderen coli bacteriën.
- Verwijder M9 buffer en voeg 50-100 ul van 30 ug / ml TMP werkoplossing op de worm de pellet in 1,5 ml microcentrifugebuis. Wikkel de 1,5 ml microcentrifugebuis in folie omgevingslicht blokkeren en schud voorzichtig een rotator gedurende 15 minuten in de folie verpakte 1,5 ml microcentrifugebuis. Breng de wormen in de TMP / worm oplossing voor een groot unseeded NGM plaat.
- Expose de wormen op de NGM plaat aan UV 350 uJ (X100) met een Stratalinker 2400. Voeg wormen een OP50 met NGM plaat en incubeer in het donker gedurende 5 uur.
- Pick 50 transgene wormen tot ongeveer 10 geplaatste platen (2-5 wormen elke plaat). Transfer P0 is om nieuwe platen elke 24 uur gedurende 3 dagen.
- Pick 250 klonale F1 eennimals (1 dier per plaat). Kloon van 2 tot 4 F2 dieren uit elke F1 plaat. Controleer F3 dieren voor een 100% transmissielijn kijk door naar (p) ofm-1 :: GFP expressie patroon onder een ontleedmicroscoop fluorescentiemicroscoop.
- Outcross de laatste geïntegreerde regel (s) met wildtype N2 dieren 5 keer. We noemen de uiteindelijke geïntegreerde lijn pyIs500 en de GFP-gemerkte EGL-4 molecuul GFP :: EGL-4.
2. Teelt en onderhoud van dieren voor nucleaire translocatie Assays
- Cultiveer de pyIs500 dieren bij 25 ° C op standaard 10 cm NGM platen (zie hieronder voor recept) gezaaid met OP50 E. coli bacteriën 13 (figuur 1).
- Op dag 1, pick vier tot vijf L4 pyIs500 dieren uit platen gekweekt bij 25 ° C op vijf afzonderlijke 10 cm OP50 E. coli geënt platen en incubeer bij 25 ° C (dat wil zeggen, 4-5 L4 dieren per plaat).
- Op dag 4, was volwassen populations van pyIs500 dieren uit de grote NGM platen met behulp van de S-Basal buffer (zie hieronder voor recept). Wegwerp glazen pipetten om de dieren, omdat zij zich aan de zijde van plastic pipet tips.
3. Lange termijn Geur Induced nucleaire translocatie Assays
- Was de pyIs500 dieren 3 keer in S-Basal om bacteriën te verwijderen. Niet centrifugeren dieren tussen wasbeurten, maar veeleer zijn dat de dieren door de zwaartekracht zich te vestigen in een stationaire 1,5 ml microcentrifugebuis. Het is cruciaal zodat alle bacteriën verwijderd en NGM pates vrij zijn van verontreinigingen, zoals resterende bacteriën negatief zal het resultaat van de translocatie assay beïnvloeden. Ook hebben we vastgesteld dat het autoclaveren de 1,5 ml microcentrifugebuisjes een "sticky" woning op de binnenmuren van de buis die dieren veroorzaakt vast te houden aan de zijkanten, en dus gebruik maken van niet-geautoclaveerd 1,5 ml microcentrifugebuisjes produceert.
- Terwijl dieren vestigen tussen de wasbeurten, make-up thij aanpassing oplossing. Voeg 100 ml S-Basal buffer in een 100 ml afstuderen cilinder. Toevoegen aanpassing geur voor de S-basale en sluit de cilinder met een strook Parafilm. Bij het uitvoeren van benzaldehyde aanpassing 7,5 pi benzaldehyde aan 100 ml S-Basal voor butanon aanpassing 11 pl van 2-butaone aan 100 ml S-Basal. Voorzichtig omdraaien (niet schudden) het afstuderen cilinder die S-Basal en geur 30 keer om een uniforme emulsie te creëren.
- Na de laatste wasbeurt in S-Basal, dat de dieren om zich te vestigen en verwijder alle vloeistof. Label een tube "+ ve" of "aan" en de andere buis "-ve" of "unadapt". Voeg 1 ml van de aanpassing mix de aanpassing microcentrifugebuis (+ ve) en voeg 1 ml van S-Basal de onaangepaste control microcentrifugebuis (-ve). Proberen aantallen dieren tussen 100 en 200 houden in elke buis. Met enige oefening, is het mogelijk om het geschatte aantal dieren schatten in een pellet door oog.
- Plaats een 1,5 ml microcentrifugebuis dop beschermeraan elk buisje (voorkomt deksels van popping open) en plaats de buisjes op een rotator voor 80 minuten. We hebben gevonden dat blootstelling geur tussen 60 min en 80 min vergelijkbare resultaten (beide resulteren in lange termijn aanpassingsmaatregelen) oplevert. Echter, 80 min. blootstelling biedt meer consistente resultaten in onze handen. Dus alle langdurige aanpassing assays zijn gestandaardiseerd met behulp van een 80 min geur blootstelling (Figuur 2).
- Na 80 min, wassen dieren 3 keer in S-Basal. Toestaan dat dieren om zich te vestigen door de zwaartekracht tussen elke wasbeurt.
4. Korte termijn Geur-geïnduceerde nucleaire translocatie Assays
- Bij korte geur aanpassing gebruik van dezelfde werkwijze als per langdurige geur geïnduceerde translocatie assays (Stappen 3,1-3,4), maar in plaats van het incuberen pyIs500 dieren aanpassing geur voor 80 min, 30 min blootstelling gebruiken . De kwantificering van geur-geïnduceerde kerntranslocatie assays hieronder beschreven (stap 5) is hetzelfde voor lange en korte term blootstellingen.
5. Het scoren van de Geur-geïnduceerde nucleaire translocatie Event
- Maak 2% agarose pads die 5 mM natriumazide (NaN3) door het oplossen van agarose gelelektroforese in dH 2 0. Plaats een druppel gesmolten agarose met NaN 3 op een glazen microscoopglaasje. Onmiddellijk plaats nog een glas microscoopglaasje op de eerste dia om de daling van gesmolten agarose plat. Laat gedurende 30 sec, en dan zachtjes plagen elkaar de objectglaasjes het verlaten van een microscoop dia met een vlakke agarose pad van ~ 1 mm.
- Na de laatste wasbeurt in S-Basal, zodat de wormen zich te vestigen in de 1,5 ml microcentrifugebuis en alle vloeistof te verwijderen. Voeg vervolgens de dieren druppelsgewijs op de agarose pads van verschillende objectglaasjes. Het is belangrijk om de aantallen dieren per dia te houden tussen 50 en 100. Te veel dieren per dia zal bemoeilijken scoren en vaak een verstrooiing lampje dat na het blauw licht excitatie. Overtollige vloeistof kanzijn bozen uit de agarose pad met behulp van een kleine Kim-wipe. Plaats een 0,5 mm glazen cover-slip op het pad en laat gedurende 2 minuten om de NaN3 de dieren immobiliseren. Let op, kunnen dieren worden verhaald op de dia's na het scoren. De dieren herstellen van de NaN 3 verdoving na ~ 1 uur, indien overgebracht naar een geplaatste NGM plaat in een daling van de M9 buffer.
- Op dit punt is het noodzakelijk dat elke experimentator een sleutel op te sporen die slide is de experimentele (+ ve) glijbaan en die schuif is de controle (-ve) glijbaan bedenken, en geef de dia's aan een andere persoon die blind scoren de GFP: EGL-4 lokalisatie patroon. Dit regelt voor experimentator bias.
- Score tussen de 50 en 100 dieren per dia met behulp van een rechte fluorescentie microscoop met 10x, 40x en 63X vergroting doelstellingen en GFP / RFP filters. In de eerste plaats vinden dieren onder 10x vergroting met bright-field verlichting. Ten tweede, zoek de AWC neuron door het uitschakelen van de bright-veld verlichting en het gebruik van de RFP filter. De (p) ODR-1 :: DsRed schijven uitdrukking in AWB en AWC neuronen. De AWC neuronen hebben kenmerkende ovale cellichamen ten opzichte van AWB cellichamen die kleiner zijn en cirkelvormig (figuur 2).
- Zodra de AWC cellichaam is gevestigd, over te schakelen naar de GFP filter en noteer de lokalisatie van GFP: EGL-4 als kernenergie of cytoplasmatische. Met behulp van een teller kunt de experimentator te blijven kijken in het oculair, terwijl het scoren van de dia. Opmerking: 5.1-5.5 stappen worden herhaald ten minste 3 keer op verschillende dagen om statistisch significante gegevens (figuren 1-2) produceren.
6. Monitoring GFP-gelabelde EGL-4 tijdens het Herstel van lange termijn Geur Adaptation
- Na stap 3.5, verdelen de bevolking van pyIs500 dieren in meerdere porties en de score voor de nucleaire versus cytoplasmatische GFP :: EGL-4 in de AWC op tijdstip nul (dat wil zeggen, na 80 min blootstelling) en multiple latere tijdstippen (figuur 3).
- Breng zowel de controle-(-ve) en experimentele (+ ve) dieren met behulp van wegwerp glazen pipetten op NGM platen.
- Toestaan dat dieren om te herstellen voor de verschillende lengtes van de tijd en opnieuw te onderzoeken de lokalisatie van GFP :: EGL-4In AWC op elk tijdstip als in stappen 5.1 tot 5,5.
7. Materieel
NGM platen: voeg voor 1 L tot 1 L ddH 2 0: 21 g Bacto-Agar, 3 g natriumchloride (NaCl), 2,5 g Bacto-pepton. Autoclaaf Media. Na autoclaveren Koel de agar totdat de temperatuur leest 54 ° C. Voeg de volgende oplossingen: 25 ml 1M kaliumfosfaatbuffer, 1 ml 1 M magnesiumsulfaat (MgSO4), 1 ml 1 M calciumchloride (CaCl2), 1 ml Cholesterol in Ethanol (5 mg / ml stock).
1 M Tweebasisch K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Voor 500 ml: In 400 ml ddH 2 O, te ontbinden 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Stel het volume op 500 l met ddH 2 O. Filter steriliseren met behulp van een 500 ml steriele filter eenheid.
1 M monobasisch KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Voor 1 L: In 800 ml ddH 2 O, te ontbinden 136,1 g Monobasisch KH 2 PO 4. Stel het volume op 1 L met ddH 2 O. Filter steriliseren met behulp van een 500 ml steriele filter eenheid.
1 M kaliumfosfaat (K 3 PO 4) Buffer pH 6,0: Voor 1 L: In een 1 L steriele filter, voeg 868 ml van 1 M Eenbasisch KH 2PO 4. Laat het apparaat te filteren door, voeg dan 132 ml van 1 M Tweebasisch K 2 HPO 4. Laat het apparaat al het vocht te filteren. Verwijder filter unit en de pH instellen op 6,0. Bewaar bij kamertemperatuur.
S-Basal: Voor 1 L: voeg 50 ml 1 M K 3 PO 4 Buffer, pH ~ 6.0, en 20 ml 5M NaCl aq. Vul tot 1 L metddH 2 O. Autoclaaf Solution.
M9: Voor 1 L: 3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O. Vul tot 1 L met ddH 2 0. Steriliseren in autoclaaf.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voorbeeld van de lokalisatie patroon van GFP :: EGL-4In de AWC voor en na langdurige geur blootstelling wordt getoond in figuur 2. Voorafgaand aan langdurige geur blootstelling GFP :: EGL-4 is gelokaliseerd in het cytosol van de AWC (figuur 2B), en na 80 min blootstelling geur GFP :: EGL-4 is gelokaliseerd aan de nucleus van de AWC (Figuur 2D). Op het gedragsniveau, zijn dieren met cytosolische GFP :: EGL-4 in AWC aangetrokken tot een puntbron van geur (figu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De geur-geïnduceerde nucleaire invoer van een GFP-gelabelde EGL-4 molecuul hier beschreven levert een robuuste moleculaire uitlezing van olfactorische aanpassing in C. elegans. De geur geïnduceerde kerntranslocatie assays zijn eenvoudig en slechts een paar dagen voorbereidingstijd. De pyIs500 dier dat we hebben gemaakt voor deze assays, geeft een marker die de AWC neuron en de GFP-expressie gelabeld EGL-4 eiwit verlicht. Zo hebben we het gevoel dat een experimentator met weinig tot geen ervaring in het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We willen graag Scott Hamilton, en leden van de O'Halloran lab bedanken voor zorgvuldige lezing van dit manuscript. We danken ook onze anonieme reviewer voor uitstekende suggesties en inzichtelijke commentaar.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM platen |
| Natriumchloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM platen |
| Bacto pepton | Difco | DF0118-07-2 | NGM platen |
| Kalium Dibasisch | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer en NGM platen |
| Kalium monobasisch | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer en NGM platen |
| Kimwipes - Kleine | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield ChemischeCo | 43196-115 | verdunnen geuren voor chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM platen |
| Magnesium Sulfaat | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM platen |
| Natriumazide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Verdovingsmiddel |
| Agarose - UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC geur |
| Butanon, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC geur |
| Microcentrifugebuisjes - 1,5 ml Gekleurde | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glas 5-3/4 " | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV-integratie |
| Filter isoleer-fles - 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Referenties
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803(1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515(1993).
- L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016(2010).
- O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).
- O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314(1999).
- L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575(2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451(1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71(1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835(2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
