Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in<em&gt; C. elegans</em

Chao He; Jin I. Lee; Noelle L'Etoile; Damien O'Halloran

doi:10.3791/4443

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4443

⸱

22 december 2012

Chao He¹ , Jin I. Lee² , Noelle L'Etoile³ , Damien O'Halloran¹

¹Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, ²Fred Hutchinson Cancer Research Center, ³Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een moleculaire uitlezing van langdurige geur aanpassing Caenorhabditis elegans. De Protein Kinase G, EGL-4 is nodig voor een stabiele aanpassingsmaatregelen in de primaire sensorische neuron pair genoemd AWC. Tijdens langdurige geur blootstelling EGL-4 translokeert van het cytosol naar kern van de AWC.

Samenvatting

Tijdens langdurige stimulatie meeste sensorische neuronen zullen hun reactie van afnemende gevoeligheid van het signaal. De aanpassing reactie helpt vorm aandacht en ook beschermt de cellen tegen over-stimulatie. Aanpassing in de olfactorische circuit van C. elegans werd eerst beschreven door Colbert en Bargmann ^1,2. Hier de auteurs gedefinieerde parameters van de olfactorische aanpassing paradigma, dat ze vroeger een genetische screen ontwerpen te isoleren mutanten gebrekkig in hun vermogen tot aanpassing aan vluchtige geuren waargenomen door de cellen Amphid Wing type C (AWC) sensorische neuronen. Bij wildtype C. elegans dieren blootgesteld aan een aantrekkelijke AWC-waargenomen geur ³ voor 30 min zij hun gevoeligheid aan de geur en worden dan genegeerd aanpassing geur in een assay voor chemotaxis gedrag ~ 1 uur. Bij wildtype C. elegans dieren blootgesteld aan een aantrekkelijke AWC-waargenomen geur voor ~ 1 uur zij dan de aanpassing geur ac negerenhemotaxis gedrag assay voor ~ 3 uur. Deze twee fasen van olfactorische aanpassing C. elegans werden beschreven als korte termijn olfactorische aanpassing (geïnduceerd na 30 min geur blootstelling), en op lange termijn olfactorische aanpassing (geïnduceerd na 60 min geur blootstelling). Later werk van L'Etoile et al.., ⁴ ontdekt een Proteïne Kinase G (PKG) genoemd EGL-4 die nodig is voor zowel de korte termijn en lange termijn olfactorische aanpassing in AWC neuronen. De EGL-4 eiwit een nucleaire lokalisatie sequentie die nodig is voor langdurige geur aanpassingsmaatregelen maar overbodig voor kort olfactorische aanpassingsmaatregelen in de AWC ^4. Door tagging EGL-4 met een groen fluorescerend eiwit, kon de lokalisatie van EGL-4 in de AWC tijdens langdurige geur blootstelling visualiseren. Met deze volledig functioneel GFP-gemerkte EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecuul hebben we een moleculaire uitlezing van langdurige geur aanpassing in de AWC ⁵ ontwikkelen. Gebruik van deze molecular uitlezing van olfactorische aanpassing hebben we in staat geweest om zowel vooruit als achteruit genetische screens uit te voeren om mutante dieren die defect subcellulaire lokalisatie patronen van GFP :: EGL-4 exposeren in de AWC ^6,7 identificeren. Hier beschrijven we: 1) de constructie van GFP :: EGL-4 tot expressie dieren 2) het protocol voor het kweken van dieren voor langdurige geur geïnduceerde kerntranslocatie assays en 3) het scoren van de langdurige geur geïnduceerde nucleaire translocatie evenement en herstel (her-sensibilisatie) van de nucleaire GFP :: EGL-4 staat.