Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Samenvatting

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Samenvatting

Proper neuron glia interactie is essentieel om fysiologische functie van het centrale zenuwstelsel (CNS). Deze bi-directionele communicatie wordt sophisticatedly gemedieerd door specifieke signaalwegen tussen neuron en glia ^1,2. Identificatie en karakterisering van deze signaalroutes is essentieel voor het begrijpen hoe neuron glia interactie vormen CNS fysiologie. Eerder hebben neuron en glia gemengde kweken op grote schaal gebruikt voor het testen en karakteriseren signaalwegen tussen neuronen en glia. Wat we geleerd van deze preparaten en andere in vivo gereedschap heeft echter gesuggereerd dat onderlinge signalering tussen neuronen en glia vaak voor in specifieke compartimenten in neuronen (bijvoorbeeld axon, dendriet of soma) ^3. Dit maakt het belangrijk om de ontwikkeling van een nieuwe cultuur systeem dat scheiding van neuronale compartimenten maakt en in het bijzonder onderzoekt de interactie tussen glia en neurointerne axonen / dendrieten. Bovendien is de conventionele mengcultuur systeem niet kunnen differentiëren de oplosbare factoren en direct contact membraan signalen tussen neuronen en glia. Bovendien is de grote hoeveelheid neuronen en gliacellen in de conventionele co-cultuur ontbreekt het de resolutie nodig is om de interactie tussen een axon en een gliacel observeren.

In deze studie beschrijven we een nieuwe axon en glia co-cultuur systeem met behulp van een microfluïdisch platform cultuur (MCP). In dit co-cultuur systeem worden neuronen en gliale cellen gekweekt in aparte kamers die zijn verbonden via meerdere centrale kanalen. In deze microfluïdische cultuur platform, alleen neuronale processen (met name axonen) kan de gliale kant binnenkomen via de centrale kanalen. In combinatie met krachtige fluorescerend eiwit labeling, dit systeem rechtstreeks onderzoek van signaalroutes tussen axonale / dendritische en gliale interacties dergelijkes axon-gemedieerde transcriptionele regulatie in glia, glia-gemedieerde receptor handel in neuronale terminals, en glia-gemedieerde axon groei. De smalle diameter van de kamer ook significant verbiedt de stroom van de neuron verrijkte medium in de kamer gliale, vergemakkelijken sondering van de direct membraan-eiwit interactie tussen axonen / dendrieten en gliale oppervlakken.

Protocol

1. Vergadering van de Microfluïdische Cultuur Kamer (MCP)

1. MCP (figuur 1) zijn ontworpen voor open kamers compartimenten culturen van verschillende soorten cellen ^4. Het heeft meestal twee compartimenten die zijn verbonden via het centrale kanaal (3 urn in diameter). Montage van MCP met glazen bodem gerechten is noodzakelijk voor het bereiden van culturen en de daaropvolgende beeldvorming analyse.
2. Eerste laag steriele glazen bodem gerechten met polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) opgelost in natriumtetraboraat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) en werden overnacht geïncubeerd bij 37 ° C.
3. De volgende dag werden de beklede glazen bodem gerechten driemaal gewassen met ddH ₂ O en gedroogd onder steriele zuurkast. De glazen bodem gerechten zijn daarna verder bekleed met laminine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) en gedroogd onder UV licht gedurende 1 uur. Beklede schalen zijn klaar voor gebruik of kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. Deze coating eenopnieuw nodig plating neuronen en astrocyten in de co-cultuur.
4. Om de cultuur platform monteren platforms werden microfluïdische cultuur bovenop de gecoate glazen bodem gerechten centrale verbindingskanalen op de onderkant om een ​​goede afdichting te vormen. Regelmatige neuron of astrocyten voedingsbodems toegevoegd (de cel plating gebieden) aan beide zijden (fig. 1) in de gemonteerde MCP en gedurende 2-4 uur bij 37 ° C, om te zorgen geen lekkage tussen MCP en de glazen bodem schotel. We hebben getest met medium voor het uitplaten cellen om ervoor te zorgen is er geen lekkage. De montage van MCP op de glazen bodem schaal moet vers worden bereid voor gebruik.

2. Voorbereiding van Neuronale Cultuur en Inductie van Neuronale Axonen in gemonteerd MCP

1. Corticale neuronale celculturen werden vers bereid uit embryonale 14 tot 16 dagen oude muis hersenen. Het neuron kweekmedium is samengesteld uit neurobasal medium, 2% B27 neurobasal supplement, 2 mM glutamine door 1% van 100x glutamax en 1% penicilline-streptomysin. Na dissectie van de hersenen van muizen, werd de meninges uit de cortex onder de dissectiemicroscoop. Het weefsel werd vervolgens fijngemaakt met een scheermesje om kleine weefselblokken maken om de oppervlakte blootgesteld aan trypsine verhogen. Weefselblokken werden getrypsiniseerd (Sigma-Aldrich, 0,05% trypsine) gedurende 10 min in een 37 ° C waterbad en vervolgens gedissocieerd door trituratie voorzichtig met vuurgepolijst Pasteur pipet. Gedissocieerde cellen werden gefiltreerd door een 70 pm zeef duidelijke neuronale celsuspensie verzamelen.
2. Neuronen (2-3 x 10 ⁶ / ml, 150 ul) werden uitgezet op de cel plating gebieden rechts (figuur 1) van de geassembleerde MCP zodat neuronen kunnen hechten in de cel behouden (Figuur 1). Vers bereide neuronen werden bedekt met neuron plating medium dat met 5% foetaal bovine serum (Hyclone) aangevuld in de regelgevingr neuron kweekmedium. Omdat alleen de neuronen die hechten in de cel bewaargebied kunnen axonen groeien tot de andere kant van de samengestelde MCP door centrale kanalen, is het belangrijk om plate hoge dichtheid van neuronen in de cel plating gebied zorgen voor voldoende neuronen aan de cel retentiegebied. Een representatief beeld van hoge dichtheid van neuronale axonen wordt getoond in Figuur 2A.
3. De volgende dag werd het neuron plating medium vervangen door kweekmedium regelmatig neuron. Veranderende medium werd bewerkstelligd door voorzichtig afzuigen van het medium van de cel plating ruimte van de kamer, maar niet van de cel retentiegebied van de samengestelde MCP, om luchtbellen in de cel retentiegebied en de centrale verbindingskanalen voorkomen. Luchtbellen zal het axon uitgroei en boeking achteraf ernstig belemmeren in de centrale kanalen in de MCP. Gliale cellen afgeleide neurotrofe factor (GDNF, 10-20 ng / ml) werd toegevoegd aan de andere (links)van de kamer op dezelfde dag aan de inductie van axon uitgroei ⁵ vergemakkelijken van de neuronale zijde en kras door centrale kanalen van het geassembleerde MCP (Figuur 2A). Eerlijk bedrag van spontane neurietuitgroei zonder GDNF wordt ook waargenomen vanuit de neuronale kant en cross via centrale kanalen van de geassembleerde MCP. Axonen die doorlopen in het centrale kanaal worden vaak waargenomen 2-3 dagen na uitplaten. Zodra de axons gaan in het centrale kanaal, die doorgaans naar de andere zijde binnen een dag. Axonen gewoonlijk intact gedurende ten minste een week na het invoeren van de andere kant.

3. Toevoeging van Cultured Astrocyten om MCP aan een Gecompartimenteerde Co-cultuur systeem in te stellen

Primaire astrocyt culturen werden bereid uit de P1-3 muis pup hersenen. De hersenen dissociatie procedure lijkt op de neuronale celisolatie hierboven beschreven procedure. Astrocyten werden voor het eerst uitgeplaat in 10 cm schotel die voorafBekleed met polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). De astrocyt kweekmedium (DMEM, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomysin) werd elke dag twee dagen om het puin. Daarna werd het medium elke drie dagen.

1. Astrocyten 90% confluent worden en vormen een monolaag na 7 dagen. Confluente astrocyten werden getrypsiniseerd en 150 ul geresuspendeerd astrocyten (1x10 ⁶ / ml) werden opnieuw uitgeplaat in de cel plating gebied van de linker zijde van het geassembleerde MCP wanneer axons gaat invoeren of zijn juist in de linkerkant van de samengestelde MCP. Astrocyten werden meestal bedekt 4-5 dagen na de neuronen waren verguld. GDNF werd eerst verwijderd voordat de re-plating van de astrocyten in de linkerkant van de MCP. Re-plated astrocyten werden bevestigd in de cel retentiegebied, zoals blijkt uit de GFAP immunokleuring (figuur 1). Minimale mediumstroom tussen beide zijden van de kamers (bepaald door fluorescentie dja) gevonden in de MCP, zoals eerder getoond ^4,6.
2. Astrocyten 90% confluent worden en vormen een monolaag na 7 dagen. Confluente astrocyten werden getrypsiniseerd en 150 ul geresuspendeerd astrocyten (1 x 10 ⁶ / ml) werden opnieuw uitgeplaat in de cel plating gebied van de linker zijde van het geassembleerde MCP wanneer axons gaat invoeren of alleen zijn opgenomen in de linker zijde van het geassembleerde MCP. Astrocyten werden meestal bedekt 4-5 dagen na de neuronen waren verguld. GDNF werd eerst verwijderd voordat de re-plating van de astrocyten in de linkerkant van de MCP. Re-plated astrocyten werden bevestigd in de cel retentiegebied, zoals blijkt uit de GFAP immunokleuring (figuur 1). Minimale mediumstroom tussen beide zijden van de kamers (bepaald door fluorescentie kleurstoffen) gevonden in de MCP, zoals eerder getoond ^4,6.
3. Na de re-plating van de astrocyten, axons dat de linkerzijde van de samengestelde MCP ingevoerde directe interactie met de Astrocytes door ofwel direct axonale contact of afgifte van oplosbare factoren. Immunokleuring van astrogliale plasmamembraan glutamaattransporter GLT1 en neuronale βIII-tubuline werd uitgevoerd om de interactie tussen axonen en astrocyten visualiseren, zoals in figuur 2D-F.

Resultaten

Time-lapse imaging analyse van axon-geïnduceerde GLT1 promotor activering in astrocyten

De compartimenten neuron en astrocyt co-cultuur systeem slechts de neuronale processen, vooral de axonen, selectief interactie met astrocyten. Na de succesvolle oprichting van axon en astrocyten (of andere gliacellen) co-cultuur in de gemonteerde MCP, kan verschillende types van axon-glia interacties worden bestudeerd, zoals; axon-geïnduceerde activatie van astrogliale gen promoter activering, astrocyten-geï...

Discussie

De MCP based neuron en astrocyten co-cultuur systeem maakt dissectie gedetailleerde neuron astroglia signaalwegen door alleen de axons langs de centrale kanalen en interactie met de astrogliale cellen. Deze co-cultuur systeem kan eenvoudig worden ingesteld met conventionele neuron en astrocyte cultuur procedures. We hebben ook beschreef een praktische toepassing van deze co-cultuur systeem door het gebruik van een eGFP gebaseerde reporter voor het aantonen van axon-afhankelijke GLT1 promotor activering in astrocyten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Foetaal runderserum	Hyclone	SH30070.03	voor het plateren neuron voor neuron cutlure medium
Foetaal runderserum	Sigma-Aldrich	F4135	voor astrocyten kweekmedium
Gliale afgeleide zenuw factor	R & D systems	212-GD	Toepassing 10-20 ng / ml tot neuron kant van de kamer
Dulbecco Modified Eagle Medium hoge glucose	Sigma-Aldrich	11995
70 mm cel zeef	BD Falcon	352350
Steriele glazen bodem schaal	MatTek Corporation
Microfluïdische cultuur platforms	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 putjes van de petrischaal	Cellstar	657 160
			Neuron kweekmedium Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamaat door 1% 100x Glutamax 1% penicilline-streptomysin
			Neuron kweekmedium voor plating cel Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamaat door 1% 100x Glutamax 1% penicilline-streptomysin 5% foetaal bovine serum SH30070.03
			Astrocyten kweekmedium Dulbecco gemodificeerd eagle medium hoog glucosegehalte 10% foetaal bovine serum F4135 1% penicilline-streptomysin
			Tabel 1. Materialen die worden gebruikt in de microfluïdische cultuur platform op basis van neuronale axon en glia co-cultuur systeem.