Methodenartikel

Trans-vivo Vertraagd Type Overgevoeligheid Assay voor Antigen Specifieke Verordening

DOI:

10.3791/4454

⸱

2 mei 2013

 ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een waardevolle diagnostische test die zouden kunnen worden gebruikt om de terugtrekking van immunosuppressie na transplantatie beslist zo verhoogd risico op afstoting. De test maakt gebruik van de principes van Delayed Type Overgevoeligheid en biedt nauwkeurige beoordeling van zowel donor-specifieke effector en regulerende immuunreacties gemonteerd door de ontvangers.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vertraagde overgevoeligheidsreactie (DTH) is een snelle in vivo manifestatie van T-cel-afhankelijke immuunrespons tegen een vreemd antigen (Ag) dat de gastheer immuunsysteem ervaren in het recente verleden. DTH reacties worden vaak verdeeld in een sensibiliseringsfase, verwijzend naar de oorspronkelijke antigen ervaring en een uitdaging fase, die volgt meestal enkele dagen na sensibilisering. Het ontbreken van een vertraagde overgevoeligheid reactie op een recall Ag aangetoond door huidtest wordt vaak beschouwd als een bewijs van anergie. De traditionele DTH assay daadwerkelijk gebruikt bij de diagnose van vele microbiële infecties.

Ondanks die soortgelijke immuun functies zoals lymfocytinfiltratie, oedeem, en weefsel necrose, de directe DTH is geen haalbare diagnostische techniek bij transplantatiepatiënten vanwege de mogelijkheid van directe injectie resulteert in sensibilisatie voor donorantigenen en verlies van het transplantaat. Om dit probleem te voorkomen, de bromeen naar mouse "trans-vivo" DTH assay ontwikkeld 1,2. Deze test is in essentie een transfer DTH assay, waarbij humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en specifieke antigenen werden subcutaan geïnjecteerd in de oorschelpen of voetzool van een naïeve muis en DTH-achtige zwelling wordt gemeten na 18-24 uur 3. Het antigeen presentatie door menselijke antigeen presenterende cellen zoals macrofagen en DCs tot T-cellen in zeer vasculaire muis weefsel activeert de inflammatoire cascade en trekt muis immune cellen resulteert in zwelling reacties. De respons is antigeen-specifiek en vereist vooraf antigeen overgevoeligheid. Een positieve donor-reactieve DTH respons in de Tv-DTH-test weerspiegelt dat de transplantatie patiënt een pro-inflammatoire immuun dispositie richting graft alloantigenen heeft ontwikkeld.

Het belangrijkste kenmerk van deze assay is dat het ook kan worden gebruikt om regulatoire T cellen, die bystander suppressie veroorzaakt detecteren. Omstander onderdrukking van eenDTH respons recall in aanwezigheid van donor antigeen kenmerkend transplantatieontvangers met aanvaarde allografts 2,4-14. De bewaking van transplantatie ontvangers voor alloreactiviteit en regulering door Tv-DTH kan een subset van patiënten die baat kunnen hebben bij vermindering van immunosuppressie zonder verhoogd risico op afstoting of verslechterende nierfunctie te identificeren.

Een veelbelovend gebied is de toepassing van de Tv-DTH assay bewaking van autoimmuniteit 15,16 en ook tumorimmunologie 17.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van lymfocyten

  1. Verzamel bloed in ACD (zuurcitraatdextrose) buizen.
  2. Isoleer PBMC van verse humane perifeer bloed lymfocyten met Separation Medium volgens standaardwerkwijzen.
  3. Was de PBMC drie keer met PBS om verontreinigende bloedplaatjes te verwijderen. Bloedplaatjes bleken te interfereren met de trans-vivo DTH assay. Maximaal toelaatbare bloedplaatjes vervuiling van PBMC voorbereiding is ≤ 1x10 7 / injectie.
  4. Als er een merkbare rode bloedcel vervuiling, voeren lysis van rode bloedcellen met ACK lysis buffer na de eerste wasbeurt. Verwijder ACK buffer door wassen 2x met PBS.

2. Bereiding van allogeen

  1. Isoleer PBMC van de donor perifeer bloed met behulp van de bovenstaande procedure.
  2. Resuspendeer donor PBMC in PBS bij een concentratie van 120x10 6 cellen / ml (4x10 6 cellen / ul 30).
  3. Voeg 1 uM PMSF het mengsel eiwit voorkomendegradatie.
  4. Sonificeer de celsuspensie met behulp van zeven 1-seconde pulsen met een 2 mm-sonde sonicator. (Let op: Houd het materiaal koud en het vermijden van buitensporige bubbels Indien schuimvorming optreedt, laat de celsuspensie zitten op het ijs voor een 2-3 min...)
  5. Controleer de verstoring van> 90% van de cellen met een hemocytometer.
  6. Centrifugeer het mengsel bij 14.000 rpm bij 4 ° C gedurende 20 minuten in gekoelde microcentrifuge.
  7. Overdragen supernatant naar een nieuwe 2,0 ml safe-lock buis en bepalen eiwitconcentratie.

3. Cel Voorbereiding voor injecties

  1. Voor elke injectie hoeveelheid 7x10 6 PBMC in 2,0 ml safe-lock buizen.
  2. Centrifugeer bij 6000 rpm gedurende een minuut in microfuge en verwijder het supernatant.
  3. Resuspendeer de cellen in PBS met of zonder antigenen. Stel het injectievolume 35 pl met PBS. De volgende schema wordt gebruikt voor injecties:
    Negatieve controle: PBMC + PBS
    Positieve controle: PBMC + TT / DT (25 & mu; G / injectie)
    Experimentele Antigen Specifieke Reactie: PBMC +-test Ag (4-8 ug / injectie)
    Experimentele Antigen Specifieke verordening: PBMC + testen Ag + TT / DT

4. Voormeting, Injection, en Post-meting

  1. Verdoven CB17 SCID muis met isofluraan. Meet achterste voetzool dikte met behulp van een verende remklauw. Zet remklauw in het midden van de voetzool, met een rand aan te raken de laatste wandel bal van de voet, van een benchmark de meetplaats consequent te blijven bieden. Voetzool dikte wordt geregistreerd wanneer meteraflezing is gestabiliseerd.
  2. Injecteer langzaam celsuspensies subcutaan in de voetzolen van de muizen met behulp ½ cc insuline-injectiespuiten met 28-gauge naald. Voer injectie met de naald in de richting van de tenen, en de schuine kant naar boven. (Let op: zorg ervoor dat er geen lekkage).
  3. 18-24 uur na de injectie, verdoven muis met isofluraan en herhaal de meting van de voetzool zwelling.
  4. Subtrtreden de dikte van elke voetzool voorafgaand aan de injectie uit de post injectie waarde aan de voetzool zwelling waarde te verkrijgen, drukt de gegevens in eenheden van 10 -4 centimeter. Bereken de antigeen-specifieke net zwelling door het aftrekken controle voetzool zwelling (PBMC + PBS) van de voetzool zwelling waarden verkregen van de behandelingen (PBMC + donor alloantigen, TT / DT, of donor alloantigen + TT / DT). Een positieve controle reactie op antigeen TT / DT van ≥ 25x10 -4 centimeter over achtergrond reactie op PBS te herinneren is nodig voor de test is geldig wanneer aan.
  5. Bepaal de remming van recall responsen in de aanwezigheid van donor antigenen door vergelijking van de netto opzwellen van elke injectie volgens de volgende formule:
    figure-protocol-1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Evaluatie van niertransplantatiepatiënten voor donor antigeen-specifieke reactie met Tv-DTH-assay

Aan de donor-reactieve cellulaire immuniteit bij niertransplantatiepatiënten testen we geïnjecteerd PBMC van deze patiënten met donorantigenen alleen of met een recall antigeen tetanustoxoïde (TT). Als een positieve controle werden cellen geïnjecteerd met TT alleen. We zien drie belangrijke patronen van vertraagde hypersensitiviteit bij transplantatiepatiënten (figuur 1). Alle p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De trans-vivo assay DTH is een nieuwe diagnostische test met een potentiële klinische toepassing bij de beoordeling van celgemedieerde responsen bij transplantatie, kanker en auto-patiënten. Het is waardevol omdat het niet alleen handig voor het controleren recall T effector reacties, maar ook kan detecteren T regelgevingsystemen. Een betrouwbare manier om de menselijke DTH regelgeving sporen zou de veiligheid van immunosuppressie terugtrekking voorspellen bij patiënten die kandidaat zijn voor monotherapie of tolerantie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs van dit manuscript hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag de bijdragen van AM VanBuskirk erkennen aan de ontwikkeling van ons begrip van de gereglementeerde DTH respons in transplantatiepatiënten. Dit werk werd NIH subsidies ondersteund PO1AI084853 en R01AI066219-06, en door de EU-gesponsorde One Study.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACD-buis voor bloedafnameBD02-684-26
Medium voor lymfocytenscheidingCellgro25-072-CV
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossingCellgro21-031-CMZonder calcium & magnesium
ACK-lysisbufferBioWhittaker10-548E
TT/DT of EBVSanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.TT/DT 25 μg/injectie EBV 8 μg/injectie
Proteaseremmer PMSFSigma-Aldrich78830
Eosine voor celtellingSigma-AldrichE-6003
AlloantigeenGezuiverde HLA-antigenen, synthetische allopeptiden kunnen worden gebruikt in plaats van celvrije donorlysaten
Steriele centrifugebuizen van 50 mlFisher Scientific06-443-18
Pipetten van 10 ml en pipetteerderBD Falcon13-675-20
Safe-lock buizen van 2 mlCostar3213
Pipetten van 1000 μl, 100 μl, 10 μl met steriele tips
HemocytometerFisher02-671-10
Centrifuge op volledige grootte en microcentrifugeBeckman Coulter/Eppendorf
Insulinespuiten van 1/2cc of 1ccBecton Dickinson14-826-7928 gauge
Vibracell sonicatorDivtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc2 mm probe
Wijzerplaat-diktemeterMitutoyo, Japan
SCID-muizenHarlan
IsofluraanPiramal HealthcareInhalatieanesthesie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
  2. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
  3. Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
  4. Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
  5. Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
  6. Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862(2002).
  7. Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
  8. Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
  9. Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
  10. Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
  11. Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
  12. Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
  13. Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
  14. Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
  15. Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
  16. Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
  17. Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Trans vivo DTH assayperifere mononucleaire bloedcellenmeting van voetkussenzwellingantigeenspecifieke responsregulatoire T cellendonorantigeenspecificiteitrecall antigeentestsubcutane injectiemuismodel systeem

Gerelateerde artikelen