Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Samenvatting

Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.

Samenvatting

Fate kaarten opgebouwd uit stam tracering alle cellen van een embryo, blijkt dat weefsels afstammen van elke cel van de embryo. Hoewel lot kaarten zijn zeer nuttig voor het identificeren van de voorlopers van een orgaan en voor het ophelderen van de ontwikkelingstraject waarbij de afstammeling cellen die organen bevolken de normale embryo, ze illustreren de volledige ontwikkelingspotentieel van een precursor cel of identificeren mechanismen waarmee het lot bepaald. Om te testen voor lot van de cel inzet, men vergelijkt een cel normale repertoire van nakomelingen in het intacte embryo (het lot kaart) met die uitgedrukt na een experimentele manipulatie. Is de cel het lot bepaald (vastgelegd), ongeacht de omringende cellulaire omgeving, of is het beïnvloed door externe factoren die door zijn buren? Met behulp van de uitgebreide lot kaarten van de Xenopus embryo beschrijven we hoe te identificeren, isoleren en cultuur een decollete stadium precursoren, genoemd blastovennen. Deze benadering maakt het mogelijk om te beoordelen of deze eerste cellen zijn toegewijd aan het lot zij in hun normale omgeving verwerven in het intacte embryo vereisen interacties met naburige cellen, of kan worden beïnvloed alternatieve lot drukken bij blootstelling aan andere soorten signalen.

Inleiding

Xenopus laevis embryo's zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen die embryonale cellen krijgen hun specifieke lot omdat hun eieren groot genoeg om microchirurgische benaderingen mogelijk identificeren. Bovendien ontwikkelen ze buiten zonder voedingssupplementen van het kweekmedium omdat elke cel een rijke intracellulaire levering van dooier bloedplaatjes die een intrinsieke energie store. Een belangrijk voordeel voor het bestuderen van de mechanismen waarmee lot van de cel wordt bepaald is een uitgebreide reeks lot kaarten van de splitsing fase blastomeren (van 2 - tot 32-cell fasen) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} De kaarten werden geconstrueerd door microinjecting een detecteerbaar molecuul in een, identificeerbaar blastomeer en controle later in ontwikkeling die weefsels worden bevolkt door de gemerkte nageslacht. Consistent lot kaarten zijn mogelijk omdat de kardinaal assen van de embryo betrouwbaar kan worden geïdentificeerd in vele Embryos. Ten eerste, in alle wild-type embryo's het dier halfrond is gepigmenteerd, terwijl de plantaardige halfrond is het niet. Anderzijds de ingang van het sperma bij bevruchting vindt een contractie van het dier halfrond pigmentatie naar de toekomst buikzijde, in veel embryo's een pigmentatie verschil kan daarom gebruikt worden om onderscheid te maken tussen dorsale en ventrale kanten. Derde, de eerste splitsplek vore benadert het sagittale middenvlak in de meeste embryo's, en kan dus worden gebruikt om de rechter-en linkerzijde van de embryo identificeren. Het lot kaarten zijn ook afhankelijk van het feit, dat op natuurlijke wijze bevruchte eieren vaak aankleven in regelmatige patronen die elke blastomeer identificeerbare over een grote populatie van embryo's. Hoewel er variabiliteit binnen en tussen legsels van eieren ten aanzien van pigmentatie en decollete patronen, met behulp van selectieprocedures die hierin worden beschreven kunnen cellen met voorgeschreven lot te worden geïdentificeerd met ongeveer 90% nauwkeurigheid.

Celtypes kunnen afschrikkenbepaald tijdens embryogenese door verschillende mechanismen. Intrinsieke factoren, zoals erfelijke differentieel cytoplasmatische mRNA of eiwitten, bijdragen tot verschillende aspecten van vroege patronen. Bijvoorbeeld specifieke maternale mRNA bepalen welke cellen bijdragen aan de kiemlijn, worden de endoderm, of bijdragen aan de dorsale lichaamsas (beoordeeld in ^7). Extrinsieke factoren lokaal door naburige cellen of verder af van een embryonale signalering centrum verantwoordelijk voor het induceren van specifieke weefselsoorten en patroonvorming vrijwel elk orgaansysteem. Voorbeelden van signalering centra zijn ook de organisator / node in de gastrula dat de neurale ectoderm en patronen het mesoderm induceert, en de zone van polariserende activiteit die patronen van de anterior-posterior as van de ledematen. Hoewel lot maps identificeren voorlopers van de verschillende organen en onthullen de ontwikkeling weg die hun nakomelingen in normale embryo, kunnen ze geen onderscheid tussen intrinsiekeen extrinsieke invloeden op deze cellen. Ook blijkt dat er geen volledige ontwikkeling van een cel, die nakomelingen differentiëren in het complex signaleren omgeving van de embryo. Twee experimentele benaderingen kunnen testen of een cel lot bepaald door intrinsieke factoren of daarna beïnvloed door externe factoren: 1) transplantatie van de cel naar een nieuwe locatie in het embryo, of 2) verwijderen van de cellen van de embryo, gevolgd door kweek in afwezigheid van exogeen signalen.

Beide experimentele benaderingen zijn mogelijk in Xenopus omdat de cellen groot genoeg om handmatig gescheiden. Zo hebben vele studies verwijderd enkele cellen van embryo's (tot cel-cel interacties veranderen) of getransplanteerde cellen op nieuwe plaatsen in ontvangende embryo's testen lot veranderingen (beoordeeld in ^{7, 8, 9).} Bovendien de tweede benadering van explanteren kleine aantallen cellen van verschillende gebieden van de embryo into cultuur inductieve weefsel interacties in de afwezigheid van exogene factoren verduidelijken is mogelijk omdat de cellen van het Xenopus embryo zijn gevuld met een intracellulaire voedingsstof store, de dooier bloedplaatjes. Daarom kunnen ze worden gekweekt een paar dagen in een gedefinieerd medium zonder zout nutritioneel of groeifactor aanvulling van het kweekmedium. Wij hebben deze benadering te laten zien dat dorsale dier blastomeren een autonome vermogen om neurale en dorsale mesodermale weefsels door maternaal overgeërfd mRNAs ^{10, 11} produceren en anderen aangetoond dat mesoderm specificatie van 32-cell blastomeren gebeurt zowel intrinsieke als extrinsieke informatie ¹² . Een voordeel van het kweken van cellen als explantaten is dat het medium ook kan worden aangevuld met gedefinieerde signaalfactoren te bepalen welke cel-tot-cel communicatie pathway kan het lot van de geëxplanteerde cel ^{12, 13, 14} beïnvloeden. Daarnaast kan men injecteren de blastomeer prior om cultuur mRNA tot overexpressie een gen, of anti-sense oligonucleotiden de vertaling van endogene mRNA's te voorkomen. Deze, winst-en verlies-van-functie analyses kunnen bepalen welke moleculen nodig zijn voor een autonoom uitgedrukt lot. Het lot van het explantaat te analyseren, kan de identificatie van specifieke celtypen worden uitgevoerd door standaard genexpressie (bijvoorbeeld in situ hybridisatie, RT-PCR) en immunocytochemische assays. Dit protocol biedt een eenvoudige, maar krachtige, manier om onderscheid te maken tussen intrinsieke en extrinsieke mechanismen die regelen hoe een embryonale cel zich ontwikkelt tot specifieke weefsels.

Protocol

1. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Media en Gerechten

1. Verscherpen vier tang met behulp van Alumina schurende film. Doe dit onder een dissectiemicroscoop aan het uiteinde formaat te controleren. Een pincet dient als back-up bij een tip wordt beschadigd tijdens de procedure. Autoclave vier forceps en bewaar in een steriele container.
2. Maak 500 ml elk van 0,1 x en 1,0 x kweekmedium (ofwel Marc's gemodificeerd Ringers [MMR] of zoutoplossing Gewijzigd Barth's [MBS]; recepten in ¹⁵⁾ en filter steriliseren. We routinematig gebruik MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM _CaCl2, 1 mM _MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM _NaHCO3). Bewaren bij 14-18 ° C gedurende maanden.
3. Een 2% agarose oplossing in kweekmedium (2 g agarose elektroforese gehalte in 100 ml 1X kweekmedium in een schroefdop glazen fles). Autoclaaf agarose op te lossen. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maanden en magnetron de agarose vloeibaar wanneer het volgende nodig.
4. Terwijl de agarose vloeibaar, giet ongeveer 0,5 ml op de bodem van elk putje van een steriele 24-putjes kweekplaat. Dit voorkomt dat de explantaten kleven aan het plastic.
5. Terwijl de agarose is vloeibaar, giet ongeveer 2-3 ml op de bodem van twee tot drie 60 mm petrischalen, en schud zachtjes te zorgen dat de bodem bedekt is. Deze zullen als dissectie gerechten en de agarose voorkomt embryo kleven aan het plastic als hun membranen worden verwijderd.
6. Wanneer de agarose afgekoeld en gehard, vlam het uiteinde van een 6 "Pasteur pipet tot het smelt tot een bal, en licht aanraken van het oppervlak van de agarose in elk putje van de kweekplaat. Hierdoor ontstaat een ondiepe depressie waarin het explantaat wordt geplaatst.
7. Vul elk putje van de cultuur plaat met 1X steriel kweekmedium.
8. Wanneer de agarose is afgekoeld en verhard, vul de dissectie schotel met verdunde kweekmedium (0,1 x 0,1 x MMR of MBS) naar blastomeer scheiding te vergemakkelijken.

2. Selectie van embryo

1. Verkrijgen bevruchte eieren en verwijder de gelei lagen volgens standaardprotocollen ^15. Overbrengen naar 0.5X kweekmedium in een 100 mm petrischaal.
2. Als embryo's de 2-cel stadium bereiken, sorteren die waarin de eerste splitsing doorkruisen het licht gepigmenteerde gebied in het dier halfrond (figuur 1) snijdt in een aparte schaal. Dit zullen de donoren voor de explantaten. Het resterende 2-cellige embryo's in een apart schaaltje naast de donor embryo gedurende de procedure om te dienen als controles om de sibling explantaten fase.

3. Bereiding van explantaten

1. Plaats 5 tot 10 embryo's in een dissectie schotel, maar alleen op een embryo te werken op een moment.
2. Plaats de eerste embryo zodat het doorzichtige vitelline membraan kan worden gezien, is gescheiden door een ruimte (perivitelline space) boven het oppervlak van de animale pool van de embryo. Met een geslepen forceps in je subdominant hand (linkerhand als men recht wordt overhandigd), pakt de vitelline membraan boven de perivitelline ruimte. Met een geslepen forceps in de andere hand het membraan als de eerste forceps tip en voorzichtig in tegengestelde richtingen trekken te pellen het membraan weg. Het begin-greep op een afstand van de cel die wordt ontleed, waardoor de doelcel niet beschadigd tijdens het verwijderen van het membraan. Men kan zeggen dat het membraan is verwijderd omdat het embryo zal afvlakken.
3. Pak een naburige cel met de tang in de subdominant hand en gebruik deze cel als een "handvat", zodat de cel te worden ontleed wordt niet direct geraakt. Met een pincet in de andere hand voorzichtig trek de resterende aangrenzende cellen van de gewenste blastomeer. Als middellijn cellen, die hetzelfde lot delen, gericht, kunnen ze worden verwijderd samen als een paar. Tot slot, ontleden weg het "handvat" cel.
4. Ophalen blastomeer (of blastomeer pair), met een steriele, Glas Pasteur pipet, het vermijden van luchtbellen en overmatige afzuiging. De pipet kan brand-gepolijst om scherpe randen die de cel kunnen beschadigen te verwijderen, maar we weten niet routinematig doen. Plaats de punt van de pipet Pasteur onder het oppervlak van het kweekmedium in een putje van het explantaat kweekschaal en voorzichtig verdrijven de blastomeren. Het moet schuiven in de ondiepe depressie door de zwaartekracht. Dezelfde blastomeer van meerdere embryo kunnen worden gecombineerd tot een explantaat.
5. Herhaal deze procedure met de overige embryo's in de dissectie schotel, een voor een. Na ongeveer 10 embryo wordt de dissectie schaal gevuld met celresten. Wanneer dit gebeurt, te wijzigen in een nieuwe dissectie schotel.
6. Nadat alle dissecties worden gedaan, na te gaan of de explantaten zijn in de ondiepe depressies. Zo niet, kunnen ze voorzichtig worden geduwd in de depressie met een haar lus die is gesteriliseerd in 70% ethanol en luchtgedroogd.
7. Ongeveer een uur na de laatste dissectie, verwijder vuil surrounding de genezen explantaten met een steriele glazen Pasteur pipet.
8. Cultuur de plaat van explantaten bij 14-20 ° C naast de petrischaal die de sibling, controle-embryo's. Sibling embryo's geeft de fase van ontwikkeling van de blastomeer explantaten.

4. Oogsten Explantaten voor Analyse

1. Oogst de explantaten als de broers en zussen het gewenste ontwikkelingsstadium. Deze explantaten overleven heel goed, zelfs als een deel van de cellen uit elkaar vallen. Daarom kan een bewolkte massa in de cultuur goed ontdekken die een haar loop of forceps te bepalen of een gezond explantaat begraven binnen.
2. Ophalen explantaten in een klein volume van cultuur met glazen Pasteur pipet en voorzichtig te drijven in een fixeermiddel of lysis buffer geschikt voor de assay worden uitgevoerd.

Resultaten

Het vermogen van deze assay goed te beoordelen ontwikkeling van de cel berust op de juiste ontleden blastomeer gebaseerd op het lot kaarten ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Daarom is het essentieel om embryo's te kiezen met de juiste pigmentatie patroon op de 2-cel stadium, zoals geïllustreerd in figuur 1, die vervolgens overeenstemming regelmatig splitsingspatronen, zoals geïllustreerd in figuur 2. Als men neemt de gesorteerd embryo's bij het bereiken van de vereiste decollete podi...

Discussie

De belangrijkste stappen voor een succesvolle kweken van afzonderlijke blastomeren zijn: 1) het identificeren van de juiste plaats blastomeer, 2) het behoud van een steriele, gezonde cultuur 3) ontleden cellen op het juiste deel van de celcyclus en 4) de noodzakelijke handmatige behendigheid om beschadiging tijdens dissectie en goed te dragen aan de cultuur.

Te manipuleren specifieke blastomeren is essentieel om de assen kardinaal identificeren. In Xenopus embryo kan de rugzijde wor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Alumina schurende film	Thomas Wetenschappelijke	# 6775E-38	Cursus (12 micrometer), voor groot onderhoud van een tang tips
Alumina schurende film	Thomas Wetenschappelijke	# 6775E-46	Medium (3 pm) voor fijn slijpen van forceps tips
Alumina schurende film	Thomas Wetenschappelijke	# 6775E-54	Fine (0,3 micrometer), voor het polijsten van de verlostang tips
Pincet: Dumont, Dumoxel Biologie # 5	Fine Science Tools	# 11.252-30	Deze hebben de fijne tips die het niet nodig worden geslepen, wanneer het eerst kocht. Corrosiebestendige, zodat ze kunnengeautoclaveerd worden.
Gentamicine oplossing	Sigma	G1397	Toevoegen aan medium op dezelfde dag als het gebruik