In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Samenvatting

Ectopische expressie is een techniek om de microRNA's rol in de ontwikkeling van de hersenen toe te lichten. Echter, gericht op specifieke gebieden met behulp van in-ovo elektroporatie is een uitdaging. Hier tonen we een efficiënte manier om selectief electroporate ventrale en dorsale middenhersenen regio.

Samenvatting

Niet-coderende RNA's extra spelers regulatie van genexpressie. Gerichte in ovo elektroporatie van specifieke gebieden biedt een uniek instrument voor ruimtelijke en temporele controle van een buitenbaarmoederlijke microRNA expressie. Echter, ventrale hersenstructuren zoals ventrale middenhersenen zijn nogal moeilijk te bereiken voor eventuele manipulaties. Hier tonen we een efficiënte manier om miRNA electroporate in ventrale middenhersenen met behulp van dunne platina-elektroden. Deze werkwijze biedt een betrouwbare manier om specifieke gebieden van de middenhersenen en een nuttig instrument voor in vivo studies transfecteren.

Inleiding

De erkenning van kleine niet-coderende RNA's als extra spelers voor genexpressie gestart met een nieuwe complexiteit om genomische programmering / genregulatie. Verschillende soorten niet-coderende RNA's zijn functioneel belang neurale cellen, waaronder kleine niet-coderende RNA's ^1-4. MicroRNAs (miR of miRNA) bijvoorbeeld tonen verschillende en veranderende expressie profielen in ontwikkelende hersenen ^5. Gerichte in ovo elektroporatie van kippenembryo's biedt een unieke gelegenheid voor de ruimtelijke en temporele controle van genexpressie en silencing tijdens de ontwikkeling.

Deze video to....

Protocol

1. Eisen voor In ovo Elektroporatie

1. Voorbereiden van de vectorconstruct: miR sense en antisense primers werden ontworpen na de instructies van Ambion, getemperd en geligeerd in Apal / EcoRI verteerd pSilencer U6.1 vector. Na een succesvolle transformatie van de verkregen klonen werd gekweekt en pSilencer plasmide werd geïsoleerd door alkalische lysis methode waarbij een Qiagen midi bereiding kit.
2. Elektroden: Elektroden kunnen worden gekocht of gemakkelijk worden gebouwd ^13. Wij gebruiken zelfgemaakte elektroden van platina draad (Φ = 0,2, 0,25 of 0,5 mm diameter) of in sommige gevallen een nog....

Resultaten

De omvang van de middenhersenen gebied getransfecteerd met miR zichtbaar is door de expressie van GFP van een reporter vector geïnjecteerd samen met de miR expressie vector (Figuur 2). Gebruik platina elektroden met een diameter van 0,5 mm en geplaatst parallel aan de as van AP middenhersenen leidt normaliter de transfectie van een groot gebied langs de DV-en AP-as, zoals achterhersenen, middenhersenen en soms diencephalon (fig. 2A en B). De grootte van de elektroden leidt tot een grote.......

Discussie

Deze video toont een effectieve methode om plasmide transfecteren in de neuro-epitheliale cellen van specifieke gebieden van het kuiken middenhersenen. Rechthoekige elektrische pulsen van een laag voltage kan DNA in cellen van het kuiken neurale buis te introduceren in ovo ^6,16. Echter, de nauwkeurigheid van DNA targeting vaak bemoeilijkt door grote elektrische veld, die stijgt door de relatief grote elektroden (Φ = 0,5 mm). We hebben geprobeerd om dat probleem aan te pakken met behulp van elektroden.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescentie	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscoop	Zeiss		Model: Stemi
Camera en software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8