$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Interne organen zoals het hart, hersenen, darm en ontwikkelen links-rechts (LR) asymmetrie die essentieel zijn voor hun normale functie 1. Beweeglijke cilia zijn betrokken bij het vaststellen van LR asymmetrie in gewervelde embryo's, met inbegrip van de muis, kikker, en zebravis 2-6. Deze 'LR' cilia genereren asymmetrische vloeistofstroom die nodig is om een geconserveerde asymmetrische Nodal (TGF-β superfamilie) signaalcascade in de linker laterale plaat mesoderm, waarvan men denkt dat LR patronen informatie voor ontwikkelende organen 7 activeren. Dus begrijpen mechanismen LR patroon, is het essentieel om genen te identificeren die de organisatie van LR gecilieerde cellen, de motiliteit en de lengte van LR cilia en hun vermogen om robuuste asymmetrische stromen genereren reguleren.
In de zebravisembryo zijn LR cilia in vesicle Kupffer's (KV) 2,4,5. KV bestaat uit een enkele laag van epitheelcellen monociliateddat een met vloeistof gevulde lumen omsluiten. Fate mapping is gebleken dat KV is afgeleid van een groep van ~ 20-30 cellen bekend als dorsale voorloper cellen (DFC) die migreren op de dorsale blastoderm marge in epiboly fasen 8,9. Tijdens de vroege stadia somiet, om DFC's cluster en differentiëren tot trilharen epitheelcellen vormen KV in de tailbud van het embryo 10,11. De mogelijkheid om te identificeren en te volgen DFC-in combinatie met optische transparantie en de snelle ontwikkeling van de zebravis embryo-maken zebravis KV een uitstekend modelsysteem om LR trilharen cellen te bestuderen.
Interessant, voorvaderen van de DFC / KV cellijn te behouden cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel tot 4 uur na de bevruchting (HPF), terwijl cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel en andere embryonale cellen dicht na 2 hpf 8. Maken van deze cytoplasmatische bruggen hebben we een stadium-specifieke injectie strategie morfolino oligonucle leverenotides (MO) uitsluitend DFC en knockdown de functie van een gerichte gen in deze cellen 12. Deze techniek zorgt voor chimerisch embryo's in welk gen functie wordt naar beneden geklopt in de DFC / KV afkomst ontwikkelen in het kader van een wild-type embryo. Om asymmetrische stroming analyseren KV, we injecteren fluorescerende microbolletjes in de KV lumen en opnemen kraal beweging met behulp van videomicroscopie 2. Fluïdumstroom gemakkelijk gevisualiseerd en kan worden gekwantificeerd door het volgen bead verplaatsing in de tijd.
Hier, met het stadium-specifieke DFC-targetgen knockdown techniek en injectie van fluorescerende microbolletjes in KV stromen visualiseren we een protocol dat een effectieve benadering van de rol van een bepaald gen te karakteriseren tijdens KV ontwikkeling en functie biedt.