Methodenartikel

Single-molecule Imaging van genregulatie

DOI:

10.3791/50042

⸱

15 maart 2013

 ,  , 
1Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences , 3Department of Physics, Jilin University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC), het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode is gebruikt om de expressie stochastische dynamiek van een transcriptiefactor, de λ repressor CI volgen 1.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC) het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode maakt het mogelijk om het aantal tellen eiwitmoleculen geproduceerd in een cel gedurende opeenvolgende vijf minuten tijdvensters. Het vereist een fluorescentiemicroscoop met laserexcitatie vermogensdichtheid van ~ 0,5 tot 1 kW / cm 2, die voldoende gevoelig enkele fluorescerende eiwit moleculen te detecteren in levende cellen. De fluorescerende reporter in deze methode bestaat uit drie delen: een membraan doelsequentie, een snel rijpen, geel fluorescerend eiwit en protease herkenningssequentie. De reporter wordt translationeel gefuseerd aan de N-terminus van een eiwit van interesse. Cellen worden gekweekt op een temperatuurgeregelde microscooptafel. Elke vijf minuten worden fluorescerende moleculen in cellen belicht (en later counted door analyse fluorescentiebeelden) en vervolgens photobleached zodat alleen nieuw vertaalde eiwitten geteld in de volgende meting.

Fluorescentiebeelden gevolg van deze methode kan worden geanalyseerd door het detecteren van fluorescerende vlekken in elk beeld, het toekennen aan individuele cellen en toewijzen cellen cellijnen. Het aantal eiwitten die binnen een tijdvenster in een bepaalde cel wordt berekend door de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van de spots gemiddelde intensiteit van enkele fluorescerende moleculen. We gebruikten deze methode om expressie te meten in het bereik van 0-45 moleculen in enkele 5 min tijdvensters. Deze methode ons in staat om ruis te meten in de expressie van de repressor CI λ, en vele andere mogelijke toepassingen in systeembiologie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Strain engineering Workflow

  1. Plaats sequenties coderen (a) een membraan lokalisatiesequentie, (b) een snelle rijping fluorescent eiwit en (c) een protease herkenningssequentie N-terminaal en in frame met een eiwit van interesse (bijvoorbeeld een transcriptiefactor). We gebruikten het membraan gerichte Tsr-reporter Venus 2 en gefuseerd aan de protease herkenningssequentie Ubiquitin (Ub) het aantal uitgedrukt bacteriofaag λ repressor CI eiwitmoleculen tellen. Details over hoe construeerden wij het ​​fusieproteïne Tsr-Venus-Ub-CI, vervanging van de wild-type coderende gebied CI en waarin de construct in de E. coli chromosoom met λ Red recombinatie 3 zijn beschreven in ref. 1.
  2. Controleer of alle wijzigingen door sequencing.
  3. Transformeren van een plasmide dat codeert voor een protease specifiek de herkenningssequentie hierboven gebruikte een stam die het fluorescerende reporter en eiwit van interessein translationele fusie. We gebruikten de protease Ubp1, die onmiddellijk splitst na de C-terminale residu Ubiquitin 4.

2. Cultuur Cellen en Bereid Sample

  1. Kies een E. coli kolonie van belangstelling van een vers gestreepte agarplaat in 1 ml M9 minimale media 5 aangevuld met 1X MEM aminozuren en geschikte antibiotica. Incubeer in een shaker bij gewenste temperatuur lang genoeg is om OD 600> 1,0 (optische dichtheid bij 600 nm).
  2. Verdun de cultuur in 1 ml vers M9 medium met geschikte antibiotica tot OD 600 = 0,02. Incubeer in een shaker bij geschikte temperatuur. Initiële celdichtheid kan worden verhoogd indien nodig voor lage temperatuur groei.
  3. Wanneer de OD 600 = 0,2-0,3 (bij 37 ° C met een eerste celkweek bij OD 600 = 0,02, zal 3-4 uur duren), start de voorbereiding van de agarose gel pad (stap 3).
  4. De cellen klaar voor beeldvorming bij OD 600 = 0.3-0,4.
  5. Breng 1 ml geïncubeerde cultuur in een 1,5 ml microcentrifugebuisje, centrifuge bij 10.000 xg gedurende 1 minuut in een benchtop microcentrifuge.
  6. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml vers M9 medium en resuspendeer de pellet voorzichtig.
  7. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut.
  8. Herhaal stap 1.6 en 1.7. Verwijder het supernatant.
  9. Voorzichtig resuspendeer in 1 ml M9 media. Cellen kunnen direct worden gebruikt voor microscoop imaging of verdund 10 - tot 100-voudige laag celdichtheden zorgen voor timelapse imaging. Merk op dat lage celdichtheden van belang zijn voor langere timelapse beeldvorming. De imaging kamer (stap 4) wordt afgedicht tijdens het experiment. Door exponentiële groei van cellen, hoge initiële cel die significant afbrekende zuurstof in de kamer na langdurige groei in het gelkussen, waardoor fluorescerende eiwit rijping en die celgroei.

3. Bereid de agarose-oplossing

  1. Weeg 10-20 mglaagsmeltende temperatuur agarose in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  2. Voeg het juiste volume M9 minimaal medium zonder antibiotica tot een 3% agarose oplossing.
  3. Verwarm de agarose oplossing gedurende 30 min bij 70 ° C te smelten, het buisje dat de oplossing volledig gesmolten en homogeen. Het gelkussen kan worden gegoten op dit punt (stap 4) of de temperatuur kan worden verlaagd tot 50 ° C en gedurende enkele uren later gebruik.

4. Bereid Gel Pad op de kamer

  1. Ongeveer 50 minuten voor beeldvorming, spoel een Microaqueduct glijbaan met water.
  2. Spoelen gereinigd een dekglas (met een stringent reinigingsmethode zoals beschreven in 6) en Microaqueduct schuif met steriel water en droog te blazen met perslucht.
  3. Plaats de rubberen pakking op de Microaqueduct zo in dat het dekt de in-en uitgangen op de glazen zijkant van de Microaqueduct dia (dit kan worden aangepast voor toepassingen inwelke media wordt doorbloed door het monster). 50 ul van toepassing agarose-oplossing (stap 3) naar het midden van de Microaqueduct dia.
  4. Top van de agarose oplossing met de gereinigde, droge dekglas.
  5. Laat de agarose oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  6. Ondertussen bereiden een celmonster (stap 2).
  7. Verwijder voorzichtig het dekglas van de bovenkant van gelkussen. Voeg 1,0 ul gewassen celkweek naar de top van het gelkussen. Wacht tot 2 minuten om de kweek te worden geabsorbeerd door het gelkussen. Het is belangrijk om niet te wachten zo lang dat de gelkussen overdries, maar lang genoeg dat cellen goed in acht worden genomen om de gel pad. De Ideale wachttijd zal variëren met de temperatuur en vochtigheid.
  8. Tijdens het wachten, drogen een ander voorgereinigde dekglas.
  9. Wordt het monster met de nieuwe dekglas zodat het dekglas en Microaqueduct schuif goed zijn uitgelijnd.
  10. Monteer de temperatuur gecontroleerde groeikamer volgens de instructies van de fabrikant.Het kan nu gebruikt worden voor beeldvorming op microscoop (stap 5).

5. Imaging en Verwerving van Timelapse Movies

  1. Zet de laser en microscoop volgens de instructies van de fabrikant (bijvoorbeeld de laser moet opgewarmd ~ 0,5 uur vóór het experiment).
  2. Vergrendelen gemonteerd kamer naar het podium insert op de microscoop. Stel de temperatuur van de groeikamer doel verwarming bij 37 ° C of andere gewenste groeitemperatuur.
  3. Als beeldvorming boven kamertemperatuur, zal de focus of gelkussen meestal aanzienlijk drift voor ~ 15 minuten na de eerste temperatuur verschuiving. In de praktijk is deze tijd gebruiken om de regio's van belang te vinden en imaging scripts als nodig te wijzigen voor een experiment.
  4. Vind cellen op de microscoop en opslaan van de stand van elke cel na gecentreerd binnen een vooraf uitgelijnd en imaging regio. Meerdere cellen kan worden afgebeeld in elke beeldopname tijdvenster. Voor timelapse beeldvorming over malle generaties ervoor dat afgebeelde cellen aanvankelijk gescheiden van andere cellen door ten minste een paar honderd micrometer zodat andere kolonies wordt de beeldvorming niet in gebied tijdens de groei.
  5. Stel laser excitatie-intensiteit bijna alle fluorescerende moleculen photobleach binnen 6 posities (Figuur 5).
  6. Toepassing van een geautomatiseerde beeldvorming script / journal verkrijgen timelapse data met het algoritme beschreven in het experimentele workflow in figuur 3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typische resultaten van een experiment CoTrAC volgen van de productie van het repressor CI λ zijn weergegeven in figuren 4 en 5. In dit experiment werden 12 kolonies afgebeeld op 5 min intervallen. Op elk tijdstip, werd de kolonie eerste autofocused en gecentraliseerd binnen de beeldvorming regio. Vervolgens werd het gecentreerde / gefocuste positie opgeslagen en een helderveld beeld werd verworven. De fase werd translocatie van ~ 0,5 pm langs de z-as van het helderveld brandpuntsvlak n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De CoTrAC methode kan worden gegeneraliseerd tot de productie van andere eiwitten waar conventionele N-of C-terminale fusies kunnen fluorescent eiwit proteïneactiviteit verstoren meten. De CoTrAC strategie heeft drie unieke voordelen ten opzichte van de huidige methoden. Eerste co-translationele fusie, zodat een molecuul van de fluorescente reporter geproduceerd voor elk molecuul van het eiwit van belang, zodat nauwkeurige telling van eiwitproductie in real time. Anderzijds de membraan gerichte reporter Tsr-Venus maakt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben geen toelichtingen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het plasmide pCG001 uiten Ubp1 werd vriendelijk door Rohan Baker op de John Curtin School of Medical Research. Dit werk werd gefinancierd door March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 en NSF LOOPBAAN award 0.746.796.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen (optioneel)
Agarose (Lage smelttemperatuur) Lonza 50100
Milli-Q H 2 O
5 x M9 zouten Volgende recept beschreven in 9
20% glucose
MgSO4
CaCl2
50 x MEM aminozuuroplossing Invitrogen 11130-051
Temperatuur-gecontroleerde groeiKamer
Stage-adapter 		Bioptechs FCS-2
Doelstelling Heater Bioptechs Model afhankelijk microscoopobjectief
Microaqueduct Schuif Bioptechs 130.119-5
Micro dekglaasjes VWR 40CIR-1 Kan moeilijk zijn bron, ook verkrijgbaar bij Bioptechs
Cover glas / slide pakking Bioptechs FCS2 0,75 mm
Fluorescentiemicroscoop Divers Voorbeeld setup: Coherente Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscoop, Olympus PlanApo 100X NA 1,45 objectieve, Metamorph software Moet laser excitatie, geautomatiseerde xyz stadium, automatisering software in staat om scripted beeldvorming en autofocus, optica staat resolving een enkele fluorescente eiwitten
EM-CCD Camera Divers Voorbeeld setup: Andor Ixon DU-898 Moet voldoende lage ruis aan een fluorescerende eiwitten boven de achtergrond te detecteren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
  2. Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
  3. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
  4. Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).
  6. Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
  7. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
  8. Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
  9. Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CoTrAC methodefluorescentiemicroscopieeiwitproductielevende cellenfotobleaching analysetime lapse imagingE coli koloniesfluorescente reporter

Gerelateerde artikelen