Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Félix Legendre; Neal Cody; Carole Iampietro; Julie Bergalet; Fabio Alexis Lefebvre; Gaël Moquin-Beaudry; Olivia Zhang; Xiaofeng Wang; Eric Lécuyer

doi:10.3791/50057

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hele Mount RNA TL

18.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50057

⸱

30 januari 2013

Félix Legendre^*¹^,² , Neal Cody^*¹ , Carole Iampietro¹ , Julie Bergalet¹ , Fabio Alexis Lefebvre¹^,² , Gaël Moquin-Beaudry¹^,² , Olivia Zhang¹ , Xiaofeng Wang¹ , Eric Lécuyer¹^,²

¹Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), ²Department of Biochemistry, Université de Montréal

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde fluorescent In situ Hybridisatie (FISH)-protocol voor het bepalen van de expressie en lokalisatie eigenschappen van RNA's die tijdens de embryogenese in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster.

Samenvatting

Beoordelen het expressiepatroon van een gen, alsmede de subcellulaire lokalisatie eigenschappen van het getranscribeerde RNA, zijn kenmerkend voor het begrijpen van de biologische functie tijdens de ontwikkeling. RNA in situ hybridisatie (ISH-RNA) is een krachtige methode voor het visualiseren RNA distributie eigenschappen, ten organismale cellulaire of subcellulaire niveau ^1. RNA-ISH is gebaseerd op de hybridisatie van een gemerkte probe nucleïnezuur (bijvoorbeeld antisense RNA, oligonucleotiden) complementair aan de sequentie van een mRNA of een niet-coderende RNA doelwit van belang ^2. De procedure vereist primaire sequentie informatie alleen te genereren sequentie-specifieke probes, kan algemeen worden toegepast op een groot aantal organismen en weefselmonsters ^3. Uit een aantal grootschalige ISH studies zijn uitgevoerd om genexpressie documenteren en lokalisatie dynamiek RNA in verschillende modelorganismen, heeft dat tot devestiging van belangrijke communautaire middelen ^4-11. Hoewel verschillende probe labeling en detectie strategieën zijn ontwikkeld de afgelopen jaren de gecombineerde gebruik van fluorescentie-gemerkt detectiereagentia en enzymatische signaalversterking stappen bieden significante verbeteringen in de gevoeligheid en resolutie van de procedure ^12. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd fluorescente in situ hybridisatie methode (FISH) gebruik tyramide signaalamplificatie (TSA) om RNA expressie en lokalisatie dynamiek opgevoerd Drosophila embryo zichtbaar. De procedure wordt uitgevoerd in 96-well plaat formaat PCR, die aanzienlijk vergemakkelijkt het gelijktijdig verwerken van grote aantallen monsters.

Protocol

1. Bereiding RNA Probe

Overzicht: De volgende sectie beschrijft de stappen die nodig zijn om Digoxigenine (Dig)-gemerkte RNA-probes die geschikt zijn voor FISH te maken. De eerste stap betreft het kloneren of PCR amplificatie van een sequentie die overeenkomt met het getranscribeerde gebied van een gen van interesse dat wordt gebruikt om een sequentie-specifieke probe te genereren. Dit kan worden bereikt door eerst het kloneren van het gen segment in een plasmide waarin de meervoudige kloneringsplaats geflankeerd door bacteriofaag promoter elementen (T7, T3 of SP6), die vervolgens kan dienen als een sjabloon voor PCR met primers flankerende de promoter sequenties bevatten , waardoor het genereren van een lineaire PCR product met verschillende promoter sequenties aan elk uiteinde (Figuur 1A). Alternatief de kloneringsstap voorkomen, kan men ook uitvoeren PCR amplificatie van genomisch DNA of cDNA met behulp van oligonucleotiden die T7, T3 of SP6 sequenties aan hun 5'-uiteinden (bv. T7 omvatten:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 'T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3' Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). De lineaire PCR-producten worden vervolgens gebruikt als sjablonen Dig gemerkte sense of antisense RNA probes afspoeling in vitro transcriptie met het geschikte polymerase (Figuur 1B). Indien de probes voor specifieke genen, raden bereiden sense en antisense RNA probes met verschillende polymerasen die nuttig zijn voor de beoordeling FISH signaal specificiteit (dat wil zeggen tenzij het gen van belang wordt getranscribeerd in de antisense oriëntatie, zullen de sense RNA probe onthullen de niveau van achtergrond signaal). In alle van de volgende stappen, moet men grote zorg om mogelijke degradatie te voorkomen door besmetting ribonucleasen (RNAses) door eerst het reinigen van alle bank en apparatuur met 70% ethanol of commerciële RNAse ontsmetting oplossingen en door het gebruik van RNAse-vrij diensten (bv. water, tips, microcentrifugebuizen).

Mamaterialen

1,5 ml microcentrifugebuisjes, (ABgene, Rochester, NY, USA Cat. Nr. 0900)
Gel-extractie kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada,. Art.-Nr. 28706).
RNAse vrij water (Wisent, Inc Cat. Nr. 809-115-CL)
RNA polymerase (T7, T3 of SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131).
RNAse-OUT Ribonuclease remmers (40 U / pl) (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr. 10777-019).
Digoxigenine (DIG) nucleotide mixen (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canada. Cat. No.11209256910).

Uitrusting

Tafelblad micro-centrifuge
Gel-elektroforese-inrichting

PCR amplificeren genspecifieke sequentie van genomisch DNA, cDNA of plasmide-DNA met een lineaire PCR product geflankeerd door bacteriofaag T7, T3 of SP6 promoter sequenties. Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor de PCR-condities.
Controleer de kwaliteit en de siZE het PCR product door agarosegelelektroforese. Accijns en zuiveren PCR product met een standaard-gel extraction kit volgens de aanbevelingen en produceert elueren het product in 50 pi buffer.
Precipiteren het PCR product door toevoeging van 5 pi 3M natriumacetaat (pH 5,2) en 150 pl ijskoude 100% ethanol en zet de buizen bij -70 ° C geroerd. Centrifugebuizen bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en was de pellet met 70% ethanol. Spin weer, verwijdert u alle sporen van ethanol en dan laten drogen de pellet. Resuspendeer in 25-50 pi RNAse-vrij water.
Transcriberen DIG gemerkte probe met 200-500 ng gezuiverd PCR product in een 20 ui reactie als volgt: 2 ui 10X T7 transcriptie buffer (Invitrogen), 1 ui (20 U / ul) van RNAse inhibitor, 2 ui Dig-NTP mix en 2 pi T7 RNA polymerase (20 U / pl). Breng het eindvolume tot 20 pi met RNAse-vrij water. Incubeer de transcriptiereactie bij 37 ° C gedurende 3-4 uur.
Pas Transcription mix tot 50 ui met RNAse-vrij water en neerslaan van de DIG gemerkte RNA probe zoals beschreven in stap 4. Resuspendeer de pellet gewassen RNA in 100 pi RNAse-vrij water. Sla de geresuspendeerde monsters bij -70 ° C.
Kwantificeren van de sonde met behulp van een nanodrop spectrofotometer. De probe kwaliteit verifiëren, voert een 1-2 ul monster op een 1-2% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide.

2. Verzameling en Fixatie van Drosophila embryo's

Overzicht: dit gedeelte wordt beschreven stappen voor het oogsten en verwerken van geënsceneerde Drosophila embryo. Afhankelijk van het aantal benodigde embryo's kunnen vliegen worden gehandhaafd in kooien populatie van verschillende grootte. De volgende stappen zijn voor verzamelingen uitgevoerd met behulp van 900 cm ³ cilindrische kooien met behulp van 100mm appelsap collectie platen. Een goede fixatie vereist de verwijdering van twee beschermende lagen rond het embryo: de buitenste chorion en de binnenste vitelline membraan ^13. Na de oogst worden de embryo's eerst ondergedompeld in een 50% bleekmiddeloplossing het chorion verwijderen en ze worden gemengd in een bifasische oplossing die heptaan (permeabilizes de vitelline membraan) en PBS met 3,7% formaldehyde. De vitelline membraan wordt vervolgens gekraakt en verwijderd door overdracht van het embryo in een tweefasig mengsel van heptaan en methanol. Goede embryo fixatie en verwijdering van de vitelline membraan is cruciaal voor het succes van de stroomafwaartse FISH procedure.

Materieel

Apple-juice agarplaten (40% appelsap, 4% sucrose, 3,5% agar, 0,3% methylparabeen) met dime-en kleinbedrijf gist pasta (bakkersgist met water gemengd tot boter consistentie)
Poedervormige paraformaldehyde (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA;. Art.-Nr. 19208)
Heptane
Methanol
3% Bleach-oplossing
20 ml glazen scintillatieflesjes (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada,. Art.-Nr. 03 tot 337-15).

Uitrusting

Bevolking kooien
Collection manden (gemaakt van een Nitex mesh en het bovenste deel van een snede 50 ml polypropyleen buis waarin een gat is gesneden in het deksel).
Kleine kwast
Tafelblad vortex

Pre-clear weldoorvoede populatie kooien met een verse appelsap / gist plaat gedurende 1 uur bij 25 ° C.
Voeg een nieuwe appelsap / gist plaat om de kooi te vroeg stadium embryo's te oogsten. Incubeer de kooi gedurende 4 uur bij 25 ° C (merk op dat ophaaltijden kan worden aangepast afhankelijk van de gewenste stappen).
Bereid een verse 37% formaldehyde oplossing door 3,7 g paraformaldehyde poeder, 70 pl 2N KOH en 7,3 ml milliQ water in een glazen scintillatieflesje onder een chemische afzuigkap. Kook de oplossing tot de paraformaldehyde poeder volledig is opgelost, daarna afkoelen tot kamertemperatuur en filtreer in nieuwe scintillatieflesje.
Bereid een bifasische oplossing fixatiecombineren 2,25 ml 1X PBS met 250 ml 37% formaldehyde in een scintillatieflesje en voeg vervolgens 7,5 ml heptaan.
Oogst de appelsap plaat uit de kooi en het verzamelen van de embryo's door het toevoegen van een beetje op kamertemperatuur leidingwater en fijn borstelen de embryo's van de plaat met de kwast. Breng de geresuspendeerde embryo's in een mand en spoel met lauw kraanwater.
Dechorionate embryo's voor 90 sec door het wassen van de collectie manden in bleekwater oplossing, spoel dan grondig met lauw kraanwater (tot chloorlucht is verdwenen).
Demonteer de collectie mand, het verzamelen van embryo's voorzichtig met een penseel en breng ze in de bifasische fixatie-oplossing. De embryo's zich ophopen op het grensvlak tussen de lagen PBS en heptaan.
Seal scintillatieflesjes en te bevestigen aan een vortex-mixer. Schud gedurende 20 minuten op de laagste stand.
Verwijder en gooi de meeste van de onderste en bovenste PBS heptaan fasen met behulp van een Pasteur pipet. Aspirerende resterende PBS / heptaan / embryo 's mengsel in de pipet. In druppelsgewijze wordt de bovenste PBS fase van de pipet, zorg ervoor dat u de embryo's te elimineren. Storten de embryo's in een 1,5 ml buis die een tweefasige oplossing van 500 ul heptaan (bovenste fase) en 500 ul methanol (onderste fase).
Schud buizen met de hand gedurende 30-45 seconden naar de vitelline membranen te kraken. Eenmaal gekraakt zullen de embryo's wegzakken in de methanol.
Gooi de bovenste fase en heptaan gebarsten embryo's in het heptaan / methanol interfase en voeg 500 pl methanol. Schud gedurende 5 sec.
3 keer wassen met methanol en bewaar het embryo bij -20 ° C (op dit punt embryo's kunnen worden opgeslagen week / maand).

3. Post-fixatie Processing, Hybridisatie en Post-hybridisatie Wast

Overzicht: Dit hoofdstuk beschrijft de processtappen voor embryo permeabilisatie voorafgaand aan de FISH, pre-hybridisatie,hybridisatie met RNA probes en post-hybridisatie wassingen. Voor de initiële stappen permeabilisatie de embryo's behandeld als een pool in een buis (stap 1-9 hieronder doel voor 10-15 pl vaste embryo / sample), maar ze zijn verdeeld in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat PCR alvorens de pre-hybridisatie (stap 10). Dit helpt ook behandeling van alle embryo waarborgen in de beginfase van het experiment. Wanneer u een FISH experiment, is het belangrijk om negatieve controles omvatten het niveau van achtergrondsignaal in afzonderlijke experimenten bepaald. Hiervoor adviseren wij met inbegrip van steekproefsgewijze een 'no-probe' en, zoals vermeld in paragraaf 1, een monster gehybridiseerd met de 'zin' RNA-probe, die meestal geeft een signaal te vergelijken met de toestand van de 'no-probe'.

Materialen:

Methanol
Fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (PBT)
Proteïnase-K 1 mg / ml voorraadoplossing (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Catalog No P2308)
Glycine (20 mg / ml voorraadoplossing)
Hybridisatieoplossing: 50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml gefragmenteerd zalmsperma-DNA, 100 ug / ml heparine.
0,2 ml halfskirted 96-well PCR-platen, ABgene, Rochester, NY, USA Cat. Geen 0900)

Uitrusting

Hybridisatie oven, digitale verwarmingsblok of water, instelbaar op 56 ° C, 80 ° C of 100 ° C, of een PCR machine.
Meerkanaalspipetten (aan te raden om wasstappen te vereenvoudigen)
Vortexmenger

Spoel de embryo's in methanol, daarna in een 1:1 mengsel van methanol: PBT en vervolgens tweemaal in PBT.
Bevestig de embryo gedurende 20 min in 1 ml van PBT met 3,7% formaldehyde (vers bereid zoals beschreven in stap 11) onder voortdurend schudden op een nutator.
Was embryo's voor 3 keer gedurende 2 minuten in PBT terwijl schommelen.
Bereid een oplossing van 3 ug / ml proteinase K (PK) verdund in PBT en voeg500 pi oplossing van monsters. Incubeer monsters gedurende 10 min bij kamertemperatuur zonder schudden. Meng embryo elke 2 min door spuiten met een pipet of door voorzichtig omkeren van de buis.
Transfer embryo monsters op ijs gedurende 1 uur.
Verplaats monsters tot kamertemperatuur en verwijder PK oplossing. Was 2 maal gedurende 2 minuten met 1 ml van PBT + 2 mg / ml glycine.
Fix monsters 20 min in 1 ml van PBT + 3,7% formaldehyde met schudden. Spoel embryo's 5 keer in PBT.
Spoel embryo met 1 ml van een 1:1 mengsel van PBT en Hyb oplossing. Vervangen met 0,5-1 ml 100% Hyb-oplossing (bij deze stap de embryo's kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen / week bij -20 ° C).
Aliquot embryo's in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat (streven naar ~ 10 tot 15 ul van geregeld embryo's / well, let er dan een groot diafragma tips gebruiken om te voorkomen beschadiging van de embryo's).
Kook 100 ul / monster van Hyb-oplossing gedurende 5 minuten en laat afkoelen op ijs gedurende 5 minuten. Deze oplossing wordt gebruikt voor monstervoorbehandeling hybridisatie (Pre-Hyb).
Voeg 100 ul / monster van Pre-Hyb-oplossing en ten minste gedurende 2 uur bij 56 ° C.
Voor elk monster verdund ~ 100 ng probe in 100 pl Hyb oplossing. Warmte bij 80 ° C gedurende 3 min afkoelen op ijs gedurende 5 min (verwarmd probes kunnen worden bewaard op ijs gedurende enkele uren).
Verwijder de Pre-Hyb oplossing uit de embryo's en te vervangen door de RNA-probe-oplossing.
Hybridiseren bij 56 ° C gedurende 12-16 uur.
Voorverwarmen de volgende wasoplossingen bij 56 ° C: (A) 200 ul / monster aan Hyb oplossing; (B) 100 ul / monster van een 3:1 mix van Hyb: PBT; (C) 100 ul / monster van een 1:1 mengsel van Hyb: PBT; (D) 100 ul / monster van een 1:3 mix van Hyb: PBT; (E) 400 ul / monster van PBT.
Spoel monsters met 100 pl wasoplossing A en voer de wasstap met 100 ul / monster van oplossingen AD bij 56 ° C gedurende 15 min elk. Vervolgens spoelmonsters 4 maal gedurende 5 min met 100 ul / monster oplossing E bij 56 ° C.
Koel de monsters tot kamertemperatuur.

4. Probe Detectie

Overzicht: Deze sectie beschrijft de antilichamen en detectiereagentia gebruikt voor het detecteren en visualiseren de verdeling van de RNA probe signaal volgende hybridisatie. Deze stappen zijn schematisch aangegeven in figuur 2. Hier presenteren wij maar de standaard detectiereagentia die we gebruiken voor robuuste signaalversterking, maar er bestaat een verscheidenheid van commercieel verkrijgbare reagentia die gebruikt kunnen worden als alternatieven, vooral bij dubbele FISH experimenten gelijktijdig samen detecteren verschillende RNA voor eiwit-RNA double kleuring. Voorbeelden van resultaten verkregen met dit protocol worden in het mRNA expressie / lokalisatie patroon mozaïek in figuur 3.

Materieel

HRP-geconjugeerd muis monoklonaal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Cat. No 200-032-156)
Biotine-geconjugeerd muis monoklonaal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Cat. Neen 200-062-156)
Streptavidine-HRP conjugaat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Cat. No.S991)
Cy3-tyramide conjugaten (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A)
DABCO montageoplossing: In een 50 ml tube Verdun 1,25 g DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan; Sigma D-2522) in 15 ml 1X PBS, vervolgens 35 ml glycerol en meng tot volledig homogeen. Door voormengen met PBS, de DABCO poeder snel opgelost. Store montage oplossing bij -20 ° C.
Objectglaasjes, dekglaasjes

Uitrusting

Vortexmenger
Multichannel pipet
Fluorescentiemicroscoop

Bereid PBTB oplossing met PBT + 1% niet-vette droge melk (gewoonlijk 50-100 ml is voldoende voor alle detectiereagens incubatie en wasstappen).
Blokkeren monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in 100 pl PBTB / sample terwijl schommelen op nutator.
Verwijder blokkeeroplossing uit embryo en incubeer monsters voor 1,5-2 uur bij kamertemperatuur met 100 ul / monster het monoklonale biotine anti-DIG antilichaam oplossing (verdund 1/400 uit voorraad in PBTB) met schudden.
Spoelmonsters 6 keer gedurende 5 minuten elk met 100 ul PBTB / monster met schudden.
Incubeer 1,5 uur bij kamertemperatuur met 75 ml / monster aan streptavidine-HRP oplossing (verdunning 1/100 uit voorraad in PBTB, 10 ug / ml eindconcentratie) met schudden.
Was monsters 6 keer gedurende 5 minuten elk 100 ul PBTB / monster met rocking (voor de DNA tegenkleuring, DAPI Verdun tot 1x werken concentratie in PBTB en deze oplossing in de eerste wasstap gebruiken).
Spoel embryo's met PBT, dan was 2 keer gedurende 5 minuten met PBS.
Incubeer monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op de nutator met 50 ul / monster van Cy3-tyramide oplossing (verdund 1/50 in tyramide amplificatie buffer). Vanaf deze stap over, zorg ervoor om monsters te houden in een licht afgeschermd stopcontact.
Spoelmonsters 6 keer gedurende 5 minuten elk met 100 ul PBS / monster nutator.
Verwijderen PBS en voeg 100-125 ul / monster montage oplossing die 70% glycerol en 2,5% (DABCO). Store monsters bij 4 ° C. Deze monsters kunnen worden opgeslagen voor meerdere jaren.
Met behulp van een breed-boring tip, resuspendeer de embryo's door voorzichtig pipetteren de monsters en de overdracht 25 ul van embryo's op een glasplaatje, plaats dan een dekglaasje op de embryo's en de afdichting op de dia met nagellak.
Analyseren embryo monsters met een fluorescentiemicroscoop.