Wij presenteren een In vivo Assay om bloedvat permeabiliteit testen. Deze assay is gebaseerd op intraveneuze injectie van een kleurstof en daaropvolgende visualisatie van de diffusie in interstitiële ruimtes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze methode is gebaseerd op de intraveneuze injectie van Evans Blue in muizen als proefdier model. Evans blauw is een kleurstof die bindt albumine. Onder fysiologische omstandigheden het endotheel is ondoordringbaar voor albumine, zodat Evans blauw gebonden aan albumine blijft beperkt binnen de bloedvaten. Onder pathologische omstandigheden die verhoogde vasculaire permeabiliteit endotheelcellen via gedeeltelijk verliezen hun nauwe contacten en het endotheel permeabel voor kleine eiwitten zoals albumine. Deze voorwaarde maakt extravasatie van Evans Blue in weefsels. Een gezonde endotheel voorkomt uitstorting van de kleurstof in de naburige gevasculariseerde weefsels. Organen met een verhoogde permeabiliteit zal aanzienlijk toegenomen blauwe kleur ten opzichte van organen met intacte endotheel. Het niveau van vasculaire permeabiliteit kan worden vastgesteld door eenvoudige visualisatie of kwantitatieve meting van de kleurstof opgenomen per milligram weefsel van proefdieren versus controle / weefsel. Twee powerful aspecten van deze assay zijn eenvoud en kwantitatieve kenmerken. Evans Blue kleurstof kan worden geëxtraheerd uit weefsels door het incuberen van een bepaalde hoeveelheid weefsel in formamide. Evans Blue absorptiemaximum is bij 620 nm en absorptie minimum is 740 nm. Door een standaardcurve voor Evans Blue, kunnen optische densiteitsmetingen worden omgezet in milligram kleurstof per gevangen milligram weefsel. Statistische analyse worden gebruikt om significante verschillen in vasculaire permeabiliteit beoordelen.
Inleiding
Vorming en instandhouding van selectieve permeabele barrières essentieel zijn voor het orgaanontwikkeling en prestaties 1,2. Endotheelcellen lijn het bloedvatlumen en vormen een semi-permeabele barrière die essentieel in het selectieve transport tussen bloed en de interstitiële ruimte van alle organen. Een adequate barrière wordt gehandhaafd door nauwe cel-cel verbindingen die streng worden gecontroleerd door groeifactoren, cytokines en andere stress gerelateerde moleculen 3. Verstoring van de endotheliale barrière kan resulteren in verhoogde permeabiliteit en vasculair lekken. Deze effecten worden gezien bij diverse ziektebeelden en het begrip van de onderstreping moleculaire signalering vereist multidisciplinaire methoden 4,5. In dit artikel beschrijven we een in vivo methode om vat permeabiliteit met behulp van een muis-model te meten.
De assay we beschrijven, ook bekend als Miles assay is een goed establchine methode vasculaire permeabiliteit in vivo te testen. De assay is gebaseerd op het feit dat, onder basale fysiologische omstandigheden albumine niet de endotheliale barrière. Evans Blue, een azokleurstof met hoge affiniteit voor albumine, geïnjecteerd in de bloedstroom van een proefdier, onder fysiologische omstandigheden wordt verwacht te worden beperkt binnen bloedvaten. Wanneer een vasculaire permeabiliteit stimulus wordt toegevoegd, lokaal of systemisch, bloedvaten gaan lekken eiwit en dus ook de Evans blauwe die is gebonden aan albumine. Dit resulteert in een snelle blauwe kleuring van weefsels die doorlatend schepen.
Succesvolle injectie van de kleurstof in de muis laterale staartader is essentieel voor de goede afloop van het experiment. Staartader injectie techniek vereist veel oefening en moeten voor worden beheerst het starten van het experiment.
Vaartuig permeabiliteit is sterk afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van de eeniMAL, dus bij het vergelijken van verschillende muizenstammen is het noodzakelijk dat de muizen of andere proefpersonen hebben bijna identieke geboortedata en gewicht. Andere factoren die de doorlaatbaarheid van de endotheliale barrière beïnvloeden zijn omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid, en zeer belangrijk, de behandeling stress van de muis. Vanwege het grote aantal factoren die de uitkomst van het experiment kunnen beïnvloeden is het altijd wenselijk dat de experiment wordt herhaald ten minste driemaal en statistische analyse uitgevoerd.
Deze test kan worden gebruikt of vaartuig permeabiliteit van muizen die genetisch gemodificeerd zijn, en muizen met verschillende genetische achtergronden vergelijken. Permeabiliteit kan worden beoordeeld in de aanwezigheid of afwezigheid van een stimulus, afhankelijk van de functie van het gen dat is gemoduleerd. Deze test kan ook worden gebruikt of om het effect van verschillende verbindingen op vaartuig permeabiliteit testen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Intraveneuze injectie van Evans Blue in de muis laterale staartader
- Bereid een 0,5% steriele oplossing van Evans blauw in PBS. Indien nodig, filter-steriliseren de oplossing voor alle deeltjes die niet is opgelost te verwijderen.
- Verstuif 200 pi Evans Blue oplossing in een spuit. Vermijd alle luchtbellen die kunnen zijn ontsnapt in de spuit.
- Plaats muizen die 8-12 weken oud zijn in een terughoudendheid apparaat, zodat het dier niet vrij mobiel, maar zijn staart kan worden behandeld.
- Plaats de muis terughoudendheid apparaat op zijn kant, zodat de laterale staartader goed zichtbaar is en naar boven gericht zijn.
- Houd u vast aan de staart met de niet-dominante hand tussen duim en wijsvinger.
- Steek de naald (gauge kleine, 27-30) op een 10-15 graden, bevel up, vooraf in de laterale staartader in de richting van het hoofd. Houd de naald en spuit parallel aan de staart.
- Do niet van toepassing tegendruk om de juiste plaatsing te bevestigen, omdat dit zou kunnen de ader instorten.
- Injecteer langzaam 200 ui Evans Blue oplossing in de staartader van de muis.
- Neem het gemak waarmee de plunjer vooruitgang, aangezien dit het bewijs van juiste plaatsing van de naald in de ader.
- Plaats de muis in zijn kooi en observeren gedurende 30 minuten.
2. Orgel en extractie van Evans Blue van de organen
- Offer de muizen door middel van cervicale dislocatie. Voor Miles test doeleinden cervicale dislocatie wordt aanbevolen als het beperkt significante interferentie met vasculaire permeabiliteit. Offeren alle muizen op hetzelfde moment, zo snel mogelijk. Werken met cohorten van 6 muizen of minder, want kort na de dood van de bloedvaten meer doorlaatbaar.
- Plaats de muizen op hun rug en pin hun voeten op een wit bord.
- Open de buik-en borstholte te thor blootACIC en buikorganen.
- Representatieve foto's om verschillen in Evans Blue extravasatie te tonen. Alle muizen op hetzelfde gebied om dezelfde lichtomstandigheden hebben voor alle muizen.
- Verzamel organen van belang en leg ze in 1,5 ml buizen
- Weeg een lege buis en breng het saldo op nul.
- Breng het weefselmonster en wegen het. Herhaal dit voor alle weefselmonsters. Weefsel kan lucht gedroogd om het watergehalte variabiliteit tussen verschillende organen elimineren.
- . Voeg 500 ul formamide aan elk weefselmonster buis.
- Breng alle buizen tot 55 ° C waterbad of warmteblok. Incubeer gedurende 24-48 uur aan Evans Blue onttrekken weefsel.
3. Kwantificering van Evans Blue geëxtravaseerd in bindweefsel
- Centrifugeer de Formamide / Evans Blue mengsel resterende pellet weefselfragmenten.
- Meet absorptie bij 610nm. Gebruik 500 ul Formamide als blanco.
- Bereken ng Evans Blue extravasatie per mg weefsel.
- Teken alle gegevens in een grafiek.
- Uitvoeren van statistische analyse om significante verschillen vast te stellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gebruikten een in vivo assay permeabiliteit naar vat lekken testen in muizen 8-12 weken oud. Deze test is nuttig in het relatieve vasculaire permeabiliteit tussen dieren van verschillende genetische achtergrond of in een stam van muizen blootgesteld aan behandelingen die het vaatstelsel beïnvloeden. Onze resultaten tonen aan dat een stam van genetisch gemodificeerde muizen hebben we in ons laboratorium een permeabel endotheel in vergelijking met wild-type muizen. Deze veranderingen zijn duidelijk op macros...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vasculaire permeabiliteit is een kritische marker voor bloedvat status. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond aanwezig zijn in verschillende systemische ziekten, zoals diabetes, hypertensie en auto-immuunziekten 6,7,8. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond worden gemedieerd door schuifspanning, groeifactoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor en fibroblastgroeifactor, ontstekingsmediatoren zoals serotonine, histamine en bradykinine 9. Extravasatie van water en kleine ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflict of concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health, R01CA142928.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| REAGENS | |||
| Evans Blue | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0,2 M fosfaat 1,5 M NaCl pH 7,4 | ||
| APPARATUUR | |||
| SPECTROFOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MUIS veiligheidstuig | Harvard Apparatus | 340012 | |
| SPUIT | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | De dikte van de naald afhankelijk van de grootte van het dier. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
Referenties
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
