Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Summary

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Abstract

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een veel gebruikte methode voor het bepalen van de interacties van verschillende eiwitten met DNA in chromatine van levende cellen. Voorbeelden zijn sequentie-specifieke DNA bindende transcriptiefactoren, histonen en hun verschillende wijzigingen staten, enzymen zoals RNA polymerasen en bijkomende factoren en DNA repair onderdelen. Ondanks de alomtegenwoordigheid, er is een gebrek aan up-to-date en gedetailleerde methoden voor zowel bank voorbereiding van materiaal en voor de nauwkeurige analyse toestaan ​​kwantitatieve metrics van interactie. Door dit gebrek aan informatie en ook omdat, zoals elke immunoprecipitatie voorwaarden wordt opnieuw geoptimaliseerd voor nieuwe sets experimentele omstandigheden, de ChIP assay is gevoelig voor fouten of slecht kwantitatieve resultaten.

Ons protocol is uiteindelijk afgeleid van baanbrekende werk op transcriptiefactor: DNA interacties ^1,2, maar bevat een aantal verbeteringen aan sensibilisatieviteit en reproduceerbaarheid voor moeilijk te verkrijgen celtypen. Het protocol is met succes gebruikt ^3,4, beide met qPCR DNA verrijking kwantificeren, of met een semi-kwantitatieve variant van de volgende protocol.

Deze kwantitatieve analyse van PCR-geamplificeerde materiaal computationeel uitgevoerd en vormt een obstakel in het assay. Belangrijke controles en andere overwegingen omvatten het gebruik van een isotype-gematchte antilichaam en evaluatie van een controlegebied van genomisch DNA, zoals een intergene gebied niet voorspeld door het bestuderen eiwit (of verwacht te worden gebonden niet wijzigingen vertonen onder de experimentele omstandigheden). Daarnaast wordt een standaard curve van het uitgangsmateriaal voor elke chip monster van absolute niveau van verrijking leiden in het proefmateriaal. Gebruik van standaard curves helpt rekening met verschillen tussen de primer sets, ongeacht hoe goed ze zijn ontworpen, en ook verschillen efficiencyschillen hele reeks template concentraties voor een enkele primer set. Ons protocol is anders dan anderen die beschikbaar zijn ^5-8 in dat we uitgebreid aan de latere, analysefase.

Protocol

1. Isolatie van Mouse milt Naïeve CD4 T-cellen

1. Offer van de muis op een humane manier die overeenkomt met Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocollen. Ontleden de milt en het in petrischaal met 10 ml DMEM met 10% FBS.
2. Plet de milt met matte uiteinden van twee glasplaatjes aan de splenocyten los. Breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis.
3. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 xg (~ 1200 rpm voor een klinische centrifuge met een typische diameter rotor) gedurende 5 min bij 4 ° C.
4. Resuspendeer cellen in 2 ml ACK buffer tot rode bloedcellen, 1 min bij kamertemperatuur (RT) lyseren. Stop de reactie door toevoeging van 8 ml DMEM met FBS.
5. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
6. Resuspendeer de cellen in 5 ml DMEM dat FBS en passeren door een 70 um zeef (BD Falcon, Cat # 352350). Tel de cellen en doorgaantot isolatie van naïeve CD4 T-cellen met een CD4 isolatie kit (Miltenyi, Cat # 130-095-248) volgens de instructies van de fabrikant. Verzamel naïeve CD4 T-cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM met FBS.

2. Bereiding van Chromatine

1. Voeg 37% formaldehyde tot een eindconcentratie van 1% aan de celsuspensie in DMEM en schud bij kamertemperatuur (bijv. met een nutator) gedurende 15 min tot verknopen DNA: eiwitcomplexen.
2. Stop verknoping door toevoeging van 1 M glycine tot een eindconcentratie van 125 mM. Blijven rocken gedurende 5 min bij RT.
3. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
4. Was de cellen door resuspenderen in 5 ml ijskoude PBS met proteaseremmers. Was in ijskoude PBS bevattende proteaseremmers 3 keer in totaal en laat de cellen door centrifugatie bij 4 ° C.
5. Resuspendeer de cellen in 1 mlijskoude cel lysis buffer met proteaseremmers. Incubeer op ijs gedurende 15 minuten. De efficiëntie van cellysis kan worden bepaald door resuspenderen een kleine hoeveelheid cellen in 0,4% trypan blauw-oplossing (Sigma, Cat # T8154) en observeren met een microscoop.
6. Verzamel de kernen door centrifugatie bij 200 xg (waarschijnlijk ~ 1200 rpm) gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig.
7. Resuspendeer de kernen in 500 ui lysisbuffer die nucleaire proteaseremmers. Incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
8. Sonificeer de cellen met behulp van een Misonix Sonicator 3000, sonde grootte 1.6 mm: niveau 4, 15 sec burst, 4 keer op het ijs. Elk monster wordt gekoeld op ijs gedurende 1-2 min voor sonificatie opnieuw oververhitting van monsters te voorkomen. Oververhitting kan de omkering van cross banden veroorzaken.
9. Centrifugeer de gesoniceerd chromatine bij 16.000 xg (~ 13200 rpm in een microcentrifuge) gedurende 5 min bij 4 ° C.
10. Neem een ​​20 pi aliquot van duidelijke supernatant, voeg DNA laadkleurstof en controleer de gesoniceerd DNA door elektroforese door een 2% agarosegel (ideale grootte van gesoniceerd DNA voor de meeste toepassingen is 200-500 bp).
11. Bepaal DNA concentratie met een UV spectrofotometer. Geschoren chromatine kan direct worden gebruikt voor het opzetten van chromatine immunoprecipitatie reactie of bewaard bij -80 ° C. Doorgaans krijgen we 7,5-10 pg DNA 2-3 X 10 ⁶ gezuiverde CD4 T-cellen per muis.

3. Chromatine immunoprecipitatie (Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij 0-4 ° C)

1. Verdun gesonificeerd chromatine een DNA concentratie van 5-10 ug / ml (totaal volume = 1 ml) in verdunningsbuffer ChIP met proteaseremmers.
2. Opslaan 100 pl (10%) als invoer. Slaan op ijs.
3. Aliquot 450 pi elk in twee 1,7 ml microfugebuisjes bestempeld als isotypecontrole (muis of konijn IgG) en het antilichaam van belang. Indien meerdere antilichamen hetzelfde isotype worden gebruikt, een isotype control voldoende om deze analyse uit te voeren is. Je zult meerdere isotypecontroles nodig als antilichamen van een andere dierlijke bron of isotype worden gebruikt.
4. Voeg 2-5 ug van specifiek antilichaam, afhankelijk van de specificiteit van het antilichaam gebruikt of isotype controle aan de respectieve buizen.
5. Schommel de buizen met een nutator nacht bij 4 ° C om de vorming van chromatine-antilichaam-complexen mogelijk.
6. Voeg 25 ul van proteïne G magnetische korrels (01:01 suspensie van gesuspendeerde korrels) in het bovenstaande mengsel en laat schommelen ten minste 2 uur bij 4 ° C. Beads Aanbevolen verkoper kan direct worden gebruikt.
7. Plaats de microfuge buizen op een magnetische standaard en laat de kralen te verzamelen over de gemagnetiseerde kant.
8. Verwijder voorzichtig de oplossing door aspiratie zonder de kralen te storen.
9. Voeg 1 ml zoutarm wassen en laat hem zachtjes schommelen gedurende 5 minuten op een nutator. Verzamel de kralen met behulp van een magnetische staan ​​en verwijder de wasoplossing. Herhaal eenmaal.
10. Voeg 1 ml van hoge zout-was-oplossing en laat rocken gedurende 5 minuten op een nutator. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische staan ​​en verwijder de wasoplossing. Herhaal eenmaal.
11. Voeg 1 ml van lithiumchloride wasoplossing en laten schommelen gedurende 5 minuten op een nutator. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische staan ​​en verwijder de wasoplossing. Herhaal eenmaal. Het gebruik van LiCl verbetert de effectieve verwijdering van niet-specifieke interacties met de chromatine korrels.
12. Voeg 1 ml TE-oplossing en laat rocken gedurende 5 minuten op een nutator. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische staan ​​en verwijder de wasoplossing.
13. Elueer het DNA van de bolletjes door toevoeging van 250 ui elutiebuffer. Rock gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Pipet uit het eluaat en sla dit materiaal in een nieuwe 1,7 ml microfugebuis. Herhaal nogmaals en combineren de eluties. Gooi de kralen.
14. Om omgekeerde verknopingen commentaar 5 M NaCl tot een eindconcentratie van 0,3 M en 1 pl RNase A (20 m g / ml) aan het geëlueerde DNA. Voeg 400 ul elutiebuffer met de ingangen opgeslagen in stap 3.2, de volume 500 pl te maken. De ingangen toe tot 0,3 M NaCl, 1 pl RNase A, 10 gl 0,5 M EDTA, 20 gl 1 M Tris-HCl pH 6,5 en 1 pl proteinase K (20 mg / ml).
15. Incubeer de buizen overnacht bij 65 ° C in een droge verwarmingsblok. Om verdamping van monsters, afdichting te voorkomen of plaats een gewicht op de buizen om ze te houden van opening. Een hybridisatie oven kan ook gebruikt worden.
16. Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 1 ml 100% ethanol en incubeer 2 uur-overnacht bij -80 ° C neer te slaan DNA.
17. Centrifugeer de buisjes bij 16.000 xg gedurende 15 min voor het pelleteren van het DNA. Was de DNA pellet een keer met 70% ethanol en drogen aan de lucht de pellet. Resuspendeer de pellet DNA in 100 ul geautoclaveerd gedestilleerd water.
18. Zuiver middels DNA QiaQuick centrifugeerkolommen en elueren in totaal volume van 50 ui elutiebuffer. Dit DNA is klaar voor gebruik voor PCR.

"> 4. Voorbereiding van de PCR-reactie (Alle stappen moeten worden uitgevoerd op het ijs)

1. Het verzamelen van alle DNA-monsters van chip en bijbehorende ingang monsters. Ook, het verzamelen van alle PCR-reagentia en primers voor doelgerichte regio en een controlegebied. Gebruik een "warme start" Taq DNA-polymerase. We zullen een SYBR Green gebaseerde bepaling om DNA amplificatie kwantificeren deze procedure, maar qPCR mastermix kits kunnen indien nodig worden gebruikt.
2. Voeg een seriële verdunning van de input DNA een standaardcurve in de qPCR analyse genereren: bijvoorbeeld 10%, 1%, 0,1% en 0,01% in elutiebuffer (van de QiaQuick spinkolommen in stap 3.18). Het concentratiebereik en de toename van deze standaard curve template set kan variëren gebaseerd op de verwachte niveaus van ChIP verrijking, etc. Breng 10 pl inbreng DNA monsters respectievelijke putjes van een 96-well plaat (Genemate, cat # T-3182-1 ), in tweevoud.
3. Doseer 10 ml ChIP DNA van isotype controle alsmede specifiek antilichaam in respectievewells in drievoud.
4. Maak een "master mix" die ofwel doel primers of controle primers (0,1 uM uiteindelijke concentratie van elke primer) en afzien van 10 ul in respectievelijke putten. Bijvoorbeeld, in de onderstaande template afzien master mix-bevattende gerichte primers in putten groen gemarkeerd en afzien master mix met controle primers in putten rood gemarkeerd.
5. Bedek de PCR plaat met optische plastic afdichtingsfolie en centrifugeer bij 500 xg in een klinische centrifuge (~ 1200 rpm) gedurende 1 min bij kamertemperatuur alles verzamelen op de bodem van de put.
6. Start de PCR reactie. We zullen gebruik maken van de LightCycler 480 II (Roche) operationele LightCycler 480SW 1.5 software om de qPCR draaien in dit voorbeeld.

Pre-incubatie: 1 cyclus: 95 ° C / 5 min.

Amplification: 40-45 cycli: 94 ° C / 5 sec, 60 ° C / 5 sec, 72 ° C/10 sec (annealingstemperatuur dient 2-3 ° C lager dan de smeltende temperature van de primers).

Smeltcurve: 1 cyclus.

Koeling: 1 cyclus.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Een

10% Input

10% Input

Isotype

Specifiek

B

1% Input

1% Input

Isotype

Specifiek

C

0,1% Input

0,1% Input

Isotype

Specifiek

D

0.01% Input

0.01% Input

E

10% Input

10% Input

Isotype

Specifiek

F

1% Input

1% Input

Isotype

Specifiek

G

0,1% Input

0,1% Input

Isotype

Specifiek

H

0.01% Input

0.01% Input

Groen: Gebruik gerichte regio primers.

Rood: Gebruik controlegebied primers.

5. Analyse

1. Programma van de qPCR software voor de kwantificering van de absolute hoeveelheid DNA. Belangrijker, het gebruik van een standaard curve te interpoleren DNA bedragen in het onbekende specifieke en isotype samples maakt de evaluatie en de matching van de kwaliteit en efficiëntie van alle primersets over het bereik van de concentraties gevonden in de monsters. Bovendien, het biedt ook een more betrouwbare methode om de Cq (C _t of C _p) waarden om te zetten tot de uiteindelijke relatieve voudige verrijking resultaten dan usingΔΔCq en bijbehorende methoden.
2. Naar het sample editor en markeer de putjes die ingangsmonsters van verschillende verdunningen (10%, 1%, 0,1% en 0,01%) met hun standaard curve waarden. Label ook de putten met onbekende chip monsters, precies zoals de PCR-plaat wordt aangelegd. In gelijkwaardige software die wordt gebruikt in andere qPCR machines, aanwijzen deelverzamelingen die overeenkomen met reacties voor elk primerpaar, standaard curve waarde en experimentele en isotypecontrole steekproef dienovereenkomstig.
3. In de LightCycler software, gaat u naar de subset editor en markeer de subsets waaronder de putten met ingang monsters evenals de onbekende chip monsters. De onbekende monsters gekwantificeerd worden met de standaardcurve gegenereerd uit de bekende concentratie invoermonsters voor de analyse. In gelijkwaardige software die wordt gebruikt in andere qPCR machines, wijzen subsets corresponding alle reacties voor elk primer paren.
4. Na de PCR-amplificatie is voltooid, voert u de analyse met "Abs Quant/2nd Afgeleide Max" en selecteer de subset voor analyse en druk op OK. In gelijkwaardige software die wordt gebruikt in andere qPCR machines, zetten Cq waarde aan de DNA hoeveelheid in elke subset.
5. Druk "berekenen", die de standaardcurve met de bekende concentratie ingangsmonsters zal genereren en de absolute hoeveelheid DNA aanwezig in de onbekende monsters weer.
6. Als de kwaliteit van geschoren DNA is goed, en als de primers binden specifiek aan de beoogde regio PCR-efficiëntie bijna 2 zijn.
7. Voer een smeltcurve analyse "Tm Bellen" van dezelfde subgroep, indien beschikbaar. Een enkele piek geeft aan dat slechts een specifiek product geamplificeerd. Amplificatie van specifieke DNA kan ook worden getest door elektroforese het PCR product met DNA ladder via een agarose gel.
8. Gegevens exporteren als een tab-gescheiden tekstbestand, dat kan worden geopend in Microsoft Excel voor verdere analyse.
9. Met behulp van Microsoft Excel, verdeel het DNA bedrag voor de specifieke antilichaam met de isotypecontrole voor gerichte primers. Herhaal deze stap voor het controlegebied primers. Indien meerdere antilichamen hetzelfde isotype worden gebruikt voor verschillende immunoprecipitaties, normaliseren elk van deze met de waarden van hetzelfde isotype controle. Bovendien, als meerdere gerichte primerparen gebruikt, de hoeveelheden DNA uit een enkele controle-primerpaar mag worden gebruikt voor het normaliseren van elk doel (figuren 1 en 2). De uitgangswaarden vertegenwoordigen de specifieke antilichaam immunoprecipitatie voudige verrijking op elke plaats ten opzichte van niet-specifieke antilichaam immunoprecipitatie achtergrond.
10. Verdeel de voudige verrijking (om controle isotype) voor gerichte primers met de vouw verrijking (om controle isotype) voor controlegebied primers om verrijking ten opzichte van een te verkrijgencontrole ongebonden regio (figuur 1). Belangrijk is op dat vanwege de vorming van standaard curves met totale input DNA voor elk monster, elk van de bovengenoemde immunoprecipitatie geïnterpoleerde waarden van de standaard curves reeds genormaliseerd en uitgedrukt als de fractie van de totale hoeveelheid door de machine software.
11. Als de stringentie van de buffers gebruikt voor immunoprecipitatie of wassen te hoog is, is het mogelijk dat een sterke amplificatie van monsters immunologisch specifieke antilichamen wordt waargenomen, terwijl de amplificatie van isotype controle immunologisch monsters worden geschonden. In een dergelijk scenario, is het beter om de hoeveelheid isotype controle ChIP aftrekken specifiek antilichaam ChIP zowel de beoogde regio en ongebonden regio. Relatieve verrijking kan worden berekend door het verschil voor gerichte regio door verschil voor ongebonden regio (Figuur 3).

Results

De Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) protocol hier gepresenteerde regelaars voor eventuele verschillen in de hoeveelheid DNA in PCR door het gebruik van een primerpaar dat ongebonden regio genoom versterkt, dus dienen als een "loading control". In het in figuur 3 hebben we bijvoorbeeld het coderende gebied van het muizen ACTB gen als een regio gebonden aan onze proteïne van interesse en de transcriptiefactor NFAT bindingsplaats op muis IL2 promoter als doelregio. Als alter...

Discussion

Het protocol biedt boven een robuuste methode nauwkeurig kwantificeren van DNA verrijking van primaire lymfocyten met chip. Een belangrijke reden robuustheid dit protocol is het opnemen van biologische repliceert. Het bovenstaande protocol gebruikt drie duplo, de verrijking waarvoor wordt onafhankelijk berekend. De uitgangen worden vervolgens gemiddeld om de verrijking en standaarddeviaties berekend dat een maat voor de variabiliteit te verstrekken. Voor elk monster drie technische replicaten worden ook uitgevoerd om de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Bewaar bij RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Bewaar bij 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Bewaar bij 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Bewaar bij 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Bewaar bij -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Los op in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Bewaar bij -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Bewaar bij -20 °C
1 M Glycine			Bewaar bij RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Bewaar bij 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Bewaar bij RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Bewaar bij 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Bewaar bij 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Bewaar bij 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Bewaar bij 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Bewaar bij 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Bereidt vers
5 M NaCl			Bewaar bij RT
0.5 M EDTA			Bewaar bij RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Bewaar bij RT
Tabel van specifieke reagentia
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Tabel van apparatuur