Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

Samenvatting

Hier beschrijven we een test voor groei Staphylococcus aureus Met hemoglobine als de enige bron van beschikbare voedingsstoffen ijzer. Deze test wordt de rol van bacteriële factoren betrokken bij hemoglobine-afgeleide ijzer aankoop.

Samenvatting

S. aureus is een pathogene bacterie die vereist ijzer uitvoeren vitale metabole functies en ziekte veroorzaken. De meest voorkomende reservoir van ijzer in de menselijke gastheer is heem, de cofactor van hemoglobine. Om ijzer te nemen van hemoglobine, S. aureus maakt gebruik van een uitgebreid systeem dat bekend staat als het ijzer-gereguleerde oppervlak determinant (ISD)-systeem ^1. Onderdelen van de Isd systeem eerst binden gastheer hemoglobine, dan halen en importeren heem, en tenslotte ijzer te bevrijden van heem in het bacteriële cytoplasma ^2,3. Deze route is ontleed door tal van in vitro studies ^4-9. Verder is de bijdrage van de ISD-systeem om infecties al herhaaldelijk aangetoond in muismodellen ^8,10-14. Tot vaststelling van de bijdrage van de ISD-systeem aan hemoglobine-afgeleide ijzer acquisitie en de groei heeft bewezen meer uitdagend. Groei assays met hemoglobine als enige ijzerbron ingewikkeld by de instabiliteit van commercieel beschikbare hemoglobine, verontreinigende vrij ijzer in het groeimedium en toxiciteit van ijzerchelatoren. Hier wordt een methode die deze beperkingen overwinnen. Hoogwaardige hemoglobine wordt bereid uit vers bloed en opgeslagen in vloeibare stikstof. Gezuiverd hemoglobine wordt aangevuld in ijzer-afbrekende medium nabootsen van de ijzer-arme omgeving waarmee ziekteverwekkers in de gewervelde gastheer. Door honger S. aureus vrij ijzer en aangevuld met een minimaal gemanipuleerde vorm van hemoglobine we groei te induceren op een wijze die volledig afhankelijk is van het vermogen om hemoglobine binden, extract heem passeren heem door de bacteriële cel envelop en afgebroken heem in het cytoplasma. Deze test zal nuttig zijn voor onderzoekers die aan de mechanismen van hemoglobin-/heme-derived ijzer acquisitie toe te lichten in S. aureus en eventueel andere bacteriële pathogenen.

Protocol

1. Zuivering van Hemoglobine van Fresh Blood

1. De verwerving van nieuwe menselijk bloed aangevuld met een antistollingsmiddel. Houden bloed op ijs of bij 4 ° C gedurende de zuivering.
2. Centrifugeer bloed gedurende 20 min bij 1500 x g. De rode bloedcellen (RBC's) zullen op de bodem van de buis. Zorgvuldig aspireren de supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig in ijskoude 0,9% (w / v) NaCl-oplossing. Centrifugeer nogmaals en was 3 keer.
3. Resuspendeer de pellet in 1 volume ijskoude 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dit zal tot lysis van de rode bloedcellen door osmotische druk. Toevoegen tolueen ~ 20% eindvolume.
4. Incubeer bij 4 ° C op een rotisserie nacht.
5. Centrifugeer het lysaat bij 20.000 xg gedurende 1 uur. Verzamel de middelste hemolysaat fractie verlaten van de tolueen (drijvend op de top) en pellet onaangeroerd. Gebruik lange hals pipet om de middenfractie verzamelen.
6. Ga door 0,44 micrometer spuitfilter. Als de oplossing deeltjes bevatmaterie en niet door het filter Herhaal stap 1.5.
7. Zuiver hemoglobine (Hb) met een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) anionuitwisselingskolom (Varian, PL-SAX 1000 Å 8 um, 150 mm x 4,6 mm). De mobiele fase A 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en mobiele fase B is 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% gradiënt van solvent B wordt geleid over 2 minuten bij 2,0 ml / min debiet. De elutie wordt gecontroleerd op absorptie (λ: 410 nm en 280 nm). Verzamelen alleen de fractie gekenmerkt door een helderrode kleur en een prominente absorptiepiek (figuur 1).
8. Dialyseer de elutie tegen fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende een nacht en vervolgens een paar uur weer. Steriliseer door passage door een 0,22 urn spuitfilter.
9. Om Hb concentratie meten standaardformulieren Hb oplossingen met bekende concentraties in PBS. Bepaal de concentratie van Hb in het monster door het mengen van de standaardoplossingen (zie de tabel met reagentia onsed) of de monsteroplossing met reagens 2x Drabkin's (bereid uit poeder) in een verhouding van 1:1. Bijvoorbeeld mix 100 ul Hb oplossing reagens 100 ul 2x Drabkin's in 96-well platen. Incubeer gedurende 15 min en meet de absorptie bij 540 nm. Teken een standaardcurve en bepaal de Hb-gehalte in het monster. Vijf tot vijftien mg / ml opbrengsten kenmerkend.
10. Run 15-20 ug gezuiverd hemoglobine op een 15% SDS-PAGE in tweevoud. Vlek een van de gels; dragen de eiwitten van andere gel op een nitrocellulosemembraan en immunoblot voor hemoglobine (figuur 2).
11. Invriezen en opslaan 1 ml porties van hemoglobine in vloeibare stikstof.

2. Voorbereiding van Iron-afbrekende Groei Media

1. Bereid Roswell Park Memorial Institute (RPMI) bouillon door oplossen van het poeder in RPMI water, voeg natriumbicarbonaat zoals aanbevolen door de fabrikant en 1% cassamino zuren (CA) (w / v). Steriliseer die door een 0,2 urn filter en opslag koelkastnereerd.
2. Bereid metaal verarmde RPMI (NRPMI) door toevoeging van 7% (w / v) Chelex 100 en overnacht mengen op een roerplaat. Verwijderen Chelex 100 door passage door een 0,2 um filter en gekoeld bewaren. Supplement media met essentiële niet-ijzermetalen: 25 uM _ZnCl2, 25 uM _MnCl2, 100 mM _CaCl2 en 1 mM _MgCl2 voorbereid als een steriele 1000 x oplossing. Gebruik wegwerp plastic containers voor deze stap om ijzercontaminatie van herbruikbare supplies te voorkomen.

3. Staphylococcus aureus met hemoglobine als enige ijzerbron

1. Streak S. aureus voor isolatie op tryptische soja-agar (TSA) van een bevroren voorraad. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-24 uur.
2. Resuspendeer ethyleendiamine-N, N'-bis (2-hydroxyfenylazijnzuur) (EDDHA) in watervrije ethanol tot 100 mM. EDDHA niet in oplossing gaan, maar wordt gesteriliseerd door ethanol.
3. Toevoegen EDDHA aan RPMI tot een eindconcentratie van 0,5 mM. ToelatenEDDHA te ontbinden gedurende ten minste 30 min alvorens de volgende stap. Door batch-to-batch variatie kan uiteindelijke concentratie EDDHA moeten worden verlaagd tot 0,25 mm om bacteriële groei mogelijk te maken.
4. Inoculeer enkele kolonies van S. aureus in 5 ml RPMI met EDDHA in 15 ml schroefdop conische buizen. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 180 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende 16-20 uur.
5. Centrifugeer het 's nachts culturen gedurende 5 min bij 7500 xg en resuspendeer de pellet in NRPMI die 0,5 mM EDDHA. Normaliseren OD ₆₀₀ tot ~ 3.
6. Bereid NRPMI die 2,5 ug per ml en 0,1-1,0 mM Hb EDDHA. Door variatie tussen de batches kan de EDDHA concentratie vereist om vrije ijzerchelaat in NRPMI variëren.
7. Subcultuur 10 pi bacteriesuspensie uit stap 3.5 tot 1 ml NRPMI + + EDDHA Hb in een 15 ml met schroefdop conische buis.
8. Incubeer de culturen bij 37 ° C gedurende 48 uur onder schudden bij 180 rpm of een rollende trommel.
9. elke 6-12 uur nemen OD ₆₀₀ metingen door verwijderen van 50 ul van de cultuur en mengen met 150 pi PBS in 96-well platen.

Resultaten

We hebben gezuiverd humaan hemoglobine uit hemolysaat met HPLC (Protocol stap 1.7). Figuur 1 toont opgenomen absorptie van het eluaat bij 280 en 410 nm golflengte. Fractie 5 werd verzameld en andere fracties werden weggegooid. Opbrengsten van vijf tot vijftien milligram per milliliter hemoglobine eluaat worden meestal verkregen. Gezuiverd hemoglobine werd geanalyseerd door SDS-PAGE in tweevoud werden de gelen ofwel gekleurd eiwitten of overgebracht op nitrocellulose en immunoblotting (Protocol stap 1,10...

Discussie

IJzer is een essentiële voedingsstof die door organismen van alle koninkrijken van het leven ^15. In gewervelde dieren, is ijzer afgezonderd om toxiciteit veroorzaakt door dit element te voorkomen. Deze opslag verbergt ook ijzer van microben in een proces dat bekend staat als nutritionele immuniteit ^16. In reactie hierop hebben ziekteverwekkers geëvolueerd strategieën die voedingswaarde immuniteit te omzeilen. Een dergelijk mechanisme is gebaseerd op hemoglobine, de meest voorkomende bron van ijzer ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens / Materiaal	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
HPLC-anionenwisselaar	Varian	PL1551-3802
Drabkin's reagens	Sigma	D5941-6VL
Hemoglobine standaard	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 natriumvorm	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standards GmbH	ANC 001
Hemoglobine een antilichaam	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
Tryptisch soja agar	BD	236920