Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Astrocyten een overvloedige celtype in de hersenen van zoogdieren, maar nog veel te leren over de moleculaire en functionele eigenschappen. In vitro astrocyten celculturen kunnen worden gebruikt om de biologische functies van deze gliacellen in detail te onderzoeken. Deze video protocol toont hoe zuivere astrocyten verkrijgen door het kweken van gemengde corticale cellen van muis pups. De methode is gebaseerd op de afwezigheid van levensvatbare neuronen en de scheiding van astrocyten, oligodendrocyten en microglia, de drie gliale celpopulaties van het centraal zenuwstelsel, in cultuur. Representatieve beelden tijdens de eerste dagen kweken de aanwezigheid van een gemengde celpopulatie en dan het tijdpunt bij astrocyten worden confluent en te scheiden van microglia en oligodendrocyten. Bovendien tonen we aan zuiverheid en astrocytaire morfologie van gekweekte astrocyten met behulp van immunocytochemische kleuringen voor goed ingeburgerd ennieuw beschreven astrocyten markers. Deze cultuur systeem kan gemakkelijk worden gebruikt om zuivere muis astrocyten en astrocyt-geconditioneerd medium te verkrijgen voor het bestuderen van verschillende aspecten van de astrocyten biologie.
Inleiding
Astrocyten een zeer overvloedig celtype in het centrale zenuwstelsel (CNS). De verhouding van astrocyten om neuronen is 1:3 in de cortex van muizen en ratten, terwijl er 1,4 astrocyten per neuron in de menselijke cortex 1. Interesse in astrocyten functie is dramatisch toegenomen in de afgelopen jaren. Een belangrijke functie van astrocyten is hun rol bij het verlenen van structurele en metabole steun aan neuronen 2,3. Nieuw ontdekte rollen voor astrocyten bestrijken een breed spectrum van functies. Deze omvatten het geleiden van de migratie van ontwikkeling axonen en bepaalde neuroblasten tijdens de ontwikkeling 4-6, functies in synaptische transmissie, synaps sterkte en informatieverwerking door neurale circuits 7-9, rollen in bloed-hersen barrière (BBB) vorming 10 en 11-13 integriteit en regulering van de cerebrovasculaire toon 14. Een ander belangrijk kenmerk van astrocyten is hun reactie op letsel. Onder pathologische omstandigheden astrocytes worden reactief en verder opreguleren de expressie van het intermediaire filament gliale fibrillaire zure proteïne (GFAP) en remmende extracellulaire matrix (ECM) proteïnen 15,16. Reactieve astrocyten bakenen de schade site van gezond weefsel door vorming van een gliale litteken, die voornamelijk bestaat uit astrocyten afgescheiden ECM-eiwitten van de chondroïtinesulfaat proteoglycan (CSPG) familie, de belangrijkste factoren die een remmende axonale regeneratie na CNS verwonding 15-17.
Astrocyten afkomstig uit radiale glia (RG) cellen tijdens de late embryogenese en de vroege postnatale leven. Na astrocyten specificatie opgetreden, astrocyten precursoren migreren hun eindposities, waar het proces van terminale differentiatie beginnen. In vivo, astrocyten lijken mature drie tot vier weken na de geboorte zoals aangegeven door hun typische morfologie 18,19. Een subpopulatie van cellen RG zetten in subventriculaire zone astrocyten (type B-cellen). Both, RG en type B cellen functioneren als astrocyten zoals neurale stamcellen (NSC's) tijdens ontwikkeling en in het volwassen respectievelijk. Net als astrocyten, RG en type B-cellen ook uitdrukking van de specifiek in de astrocyten glutamaat transporter (GLAST), hersenen lipide-bindend eiwit (BLBP) en GFAP, wat aangeeft dat deze markers niet kunnen uitsluitend worden gebruikt om specifiek te labelen volwassen astrocyten. In tegenstelling tot volwassen parenchymale astrocyten, die niet delen in de gezonde hersenen, RG en type B cellen vertonen stamcel potentieel, zoals het vermogen om zichzelf te vernieuwen. Ontregeling van astrocyten is betrokken bij talrijke ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer 20,21, de ziekte van Huntington 22, Parkinson 23, Rett-syndroom 24 en Alexander de ziekte 25. Bovendien astrocyten reageren op alle beledigingen van het CNS, wat leidt tot activatie en astrocyten astrocytische gliale littekenvorming 16,26. De astrocytaire gliale litteken dat volgende hersenen tr vormtAUMA of het ruggenmerg letsel wordt gedacht dat de belangrijkste belemmering voor neuronale regeneratie 15 zijn.
De ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en te handhaven gezuiverde populaties van cellen is essentieel voor het begrip van het zenuwstelsel. Pionierswerk door McCarthy en de Vellis stelt onderzoekers tot nu toe tot bijna zuivere culturen van astrocyten te bereiden van neonatale rat weefsel 27. Er is veel geleerd over astrocyten biologie met behulp van deze methode, die hier wordt gepresenteerd in een licht gewijzigde vorm voor het isoleren van de muis corticale astrocyten. Aanvulling in vivo studies, astrocyten en geconditioneerd medium verkregen met de beschreven in vitro cultuur waardevolle hulpmiddelen om verder inzicht te krijgen in astrocyten functies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Isolatie en Plating van Mixed corticale cellen
Gemengde corticale cel isolatie voor astrocyten culturen kunnen worden uitgevoerd met behulp van P1 tot P4 muis pups. Om een daadwerkelijke astrocyten dichtheid moet gebruiken 4 mouse pup cortices per T75 weefselkweekfles. Daarom worden in de volgende volumes protocol berekend voor een celpreparaat met 4 mouse pups.
- Alvorens de dissectie procedure voorverwarmen 30 ml astrocyten kweekmedium (DMEM, hoge glucose + 10% met warmte geïnactiveerd foetaal runderserum + 1% penicilline / streptomycine, zie tabel) tot 37 ° C. Coat een T75 kolf met 20 ml poly-D-lysine (PDL) bij een concentratie van 50 ug / ml in celkweek rang water gedurende 1 uur bij 37 ° C in de CO2 incubator.
- Voor de dissectie procedure bereidt alle nodige reagentia en materialen. Je hebt nodig: chirurgische schaar, glad fijne tang, platte tip tang, papieren handdoeken, vuilniszak, 70% ethanol eend 2 ontleden schalen (3,5 cm diameter) op ijs gevuld met 2 ml HBSS elk.
- Voorzichtig vast te houden en spuit het hoofd en de nek van de muis pup met 70% ethanol. Het dier opgeofferd door onthoofding met de schaar.
- Voer een middellijn incisie, posterior naar anterior, langs de hoofdhuid aan de schedel onthullen.
- Knip voorzichtig de schedel van de nek naar de neus. Twee extra delen uitgevoerd om verdere toegang tot de hersenen mogelijk: De eerste snede wordt anterior van de reukkwabben, de andere lager van het cerebellum met de schedel loskoppelen van de schedelbasis.
- Met behulp van de platte tip pincet, worden de craniale flappen voorzichtig bladerde naar de zijkant en de hersenen wordt afgesloten en geplaatst in het eerste ontleden schotel gevuld met HBSS. Plaats de schaal op ijs en blijven oogsten alle 4 hersenen.
- De rest van de dissectie procedure wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop. Eerst worden de reukkwabben en het cerebellum verwijderd met de fijneontleden forceps (Figuur 1B).
- Om de cortices halen, pak het achterste uiteinde van de hersenen met de fijne forceps, een incisie tussen de hemisferen uitvoeren, plaatst een tweede reeks forceps aan de gemaakte grove en afpellen van de plaatvormige structuur van de cortex van de hersenen.
- Voorzichtig ontleden de hersenvliezen van de cortex hemisferen door te trekken met de fijne pincet (Figuur 1D). Deze stap vermijdt verontreiniging van de uiteindelijke astrocyten cultuur door meningeale cellen en fibroblasten. Breng het zo voorbehandelde cortex hemisferen in de tweede schaal gevuld met HBSS en terug te sturen op ijs. Ga dus met alle 4 cortex.
- Tot slot snijd elk cortex halfrond in kleine stukjes met behulp van scherpe messen (ongeveer 4 tot 8 keer).
- Onder steriele omstandigheden, transfer cortex stukjes in een 50 ml Falcon buis en HBSS tot een totaal volume van 22,5 ml.
- Voeg 2,5 ml van 2,5% trypsine, en incubeerhet weefsel in het waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Meng door af en toe te schudden om de 10 minuten.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 xg om pellet cortex weefselstukken.
- Voorzichtig supernatant te verwijderen door decanteren. Om te voorkomen dat het weefsel pellet je kan mechanisch te behouden met behulp van een pipet. Dissociëren het weefsel in een enkele celsuspensie door toevoeging van 10 ml astrocyten plating medium en krachtig pipetteren met een pipet 10 ml plastic tot weefselstukken gedissocieerd in enkele cellen (20 tot 30 maal). Stel het volume op 20 ml met behulp van astrocyten plating medium. U kunt het bewijs van de dissociatie van de cortex weefsel in enkele cellen door het tellen van het gebruik van een hematocytometer. Een bereiding van 4 muis pup cortex moet opleveren 10 tot 15 x10 6 gescheiden enkele cellen.
- Zuig de PDL T75 kweekkolf, plate de gedissocieerde enkele celsuspensie en incubeer bij 37 ° C in de CO2 incubator.
2. Het verkrijgen van een Enriched astrocyten Cultuur
- Wijzig het medium 2 dagen na beplating van de gemengde corticale cellen en alle 3 de dagen daarna.
- Na 7 tot 8 dagen bij astrocyten en confluent overlaying microglia zitten blootgesteld aan de astrocyt laag of al los van de astrocyt laag (figuur 2), schudden T75 kolf bij 180 rpm gedurende 30 minuten op een schudapparaat voor microglia verwijderd. Verwijder het supernatant met microglia of als u wenst om cultuur en onderzoeken microglia, draai het naar beneden en plaat voor cultuur 28,29.
- Voeg 20 ml vers astrocyten kweekmedium en ga verder met het schudden van de fles bij 240 rpm gedurende 6 uur aan oligodendrocyt precursor cellen (OPC) te verwijderen. Aangezien sommige OPC's niet volledig los van de astrocyten laag, blijven krachtig schudden met de hand gedurende 1 minuut om OPC besmetting te voorkomen. Verwijder het supernatant of spin naar beneden en de plaat, als je wilt om de cultuur OPC's 29.
- Spoel het resterende confluent astrocyten laag tweemaal met PBS, zuigen de PBS, voeg 5 ml trypsine-EDTA en incubeer in de CO2 incubator bij 37 ° C. Controleer detachement van astrocyten om de 5 min en de handhaving van onthechting van astrocyten door het raken van de kolf tegen de palm van je hand (2-3 keer).
- Na astrocyten worden losgemaakt van de cultuur kolf, voeg 5 ml van astrocyten kweekmedium, spin-cellen op 180 xg gedurende 5 minuten, aspireren supernatant en voeg 40 ml verse astrocyten plating medium. Een T75 weefselkweekfles moet opleveren in 1x10 6 cellen na de eerste cel split. Cellaag in twee T75 kweekflessen en incubeer bij 37 ° C in de CO2 incubator. Verander het medium om de 2 tot 3 dagen.
- 12-14 dagen na de eerste splitsing astrocyten worden uitgeplaat in de juiste cel concentratie 24-48 uur voor het experiment. Een T75 weefselkweekfles moet opleveren rond 1,5-2 x10 6 cellen na de tweede cel split.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na isolatie van de volledige muizenhersenen (Figuur 1A), het cerebellum en de reukkwabben worden verwijderd (Figuur 1B). De cortices worden gepeld van de muis hersenstam (figuur 1C) en hersenvliezen van de individuele cortex (figuur 1D) zorgvuldig wordt verwijderd (figuur 1E). Hersenvliezen duidelijk door de meningeale slagader systeem en onvolledige verwijdering resulteert in verontreiniging van de uiteindelijke astrocyten cultuur door...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven werkwijze is gebaseerd op de astrocyt preparaat van neonatale hersenen van knaagdieren, oorspronkelijk beschreven door McCarthy en de Vellis in 1980 27. De aangepaste methode van de isolatie en de cultuur van corticale astrocyten van postnatale P1 tot P4 hersenen van muizen die hier is snel, levert zuivere primaire astrocyten en is zeer reproduceerbaar. Deze techniek kan eenvoudig worden overgedragen naar astrocyten isoleren van andere soorten, zoals van de rat en varken en andere hersengeb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Ondersteund door de Fazit Foundation Graduate Fellowship om SS, het federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF 01 EO 0803) aan KB en de Europese Commissie KP7 Subsidieovereenkomst PIRG08-GA-2010 tot 276,989, NEUREX, en de Duitse Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 van CS De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van de werkoplossing | Vennootschap | Catalogusnummer | Eindconcentratie |
| Astrocyten cultuurmedia | |||
| DMEM, hoge glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, hitte geïnactiveerd | Life Technologies | 10082-147 | Eindconcentratie: 10% |
| Penicilline-streptomycine | Life Technologies | 15140-122 | Eindconcentratie: 1% |
| Oplossing voor hersenweefsel gravenestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2,5% trypsine | Life Technologies | 15090-046 | Eindconcentratie: 0,25% |
| Ander | |||
| 70% (vol / vol) ethanol | Roth | 9065,2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | Een-003-E | 50 ug / ml |
| Water | PAA | S15-012 | celcultuur graad |
| PBS | PAA | H15-002 | celcultuur graad |
| 0,05% Probeerpsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0,45 pm Steriel filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petrischaal | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon buis | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon buis | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 weefselkweekfles | BD Falcon | 353136 | |
| Tang, fijne | Dumont | 2-1.032; 2-1.033 | # 3c; # 5 |
| Tang, platte tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm chirurgische schaar | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscoop | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscoop + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscoop + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifugeer | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Waterbad | Julabo | SW20, 37 ° C |
Referenties
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132(2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett's syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
