Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Genomische studies van menselijke kankers heeft geleid tot een schat aan informatie over genen die veranderd in tumoren 1,2,3. Een uitdaging van deze studies is dat veel genen gewijzigd en het kan moeilijk zijn om genetische veranderingen die tumorigenese van dat die incidenteel ontstaan tijdens de transformatie reed onderscheiden. Om dit onderscheid is het nuttig om een assay die kwantitatief meten van het effect van een veranderd gen op tumor initiatie en andere processen waarmee tumoren aanhouden en verspreiden. Hier wordt een snelle manier om grote aantallen kandidaat melanoom modifiers screenen zebravis met een autochtone tumor model 4 die stappen voor melanoom initiëren en onderhouden omvat. Een belangrijk reagens in deze test is de miniCoopR vector voor koppeling een wildtype kopie van het mitfa melanocyt specificatie factor een Gateway cassette recombinatie waarin kandidaat melAnoma genen worden gerecombineerd 5. De vector miniCoopR een mitfa redding minigen dat de promoter, open reading frame en 3'-ongetranslateerde gebied van het wild-type gen bevat mitfa. Het stelt ons in staat om constructies met behulp van volledige lengte open reading frames van kandidaat-melanoom modifiers. Deze individuele klonen kunnen vervolgens worden geïnjecteerd in een enkele cel Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) zebravis embryo's. De miniCoopR vector wordt geïntegreerd door Tol2-gemedieerde transgenese 6 en redt melanocyten. Omdat deze fysiek gekoppeld met de mitfa rescuing minigen worden kandidaatgenen uitgedrukt in gered melanocyten, waarvan sommige transformeren en ontwikkelen tot tumoren. Het effect van een kandidaat gen op melanoom initiatie en melanoomcellijnen eigenschappen kan worden gemeten met melanoma-overleving curves, invasie assays, antilichaamkleuring en transplantatie assays.
Protocol
1. Screening op Melanoom Begin Modifiers
- Gateway maken middelste item klonen van PCR amplificeren van de volledige lengte open leesraam van genen van belang (GOI) en genereert in pDONR 221 met BP clonase II (Invitrogen). Gebruik Multisite Gateway-technologie (Invitrogen) te recombineren p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 en miniCoopR 5 tot genen van interesse onder het mitfa promoter in de vector miniCoopR (Figuur 1A).
- Injecteer 25 picogram van elke kloon samen met 25 picogram Tol2 transposase mRNA in een cel Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Eencellige Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf) mitfa (lf) zebravis embryo's werden geïnjecteerd met de miniCoopR vector die het melanoma oncogen SETDB1 5 of EGFP, elk onder de controle van de promoter mitfa. Embryo's met melanocyt rescue werden geselecteerd en rijpen. Op 2 maanden dieren melanocyt rescue groter dan 4 mm 2 werden geselecteerd. De dieren werden wekelijks onderzocht melanomen. Tumorincidentie curves voor volwassenen bleek dat de SETDB1.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De miniCoopR methode maakt het mogelijk de expressie van genen van belang in zebravis melanocyten. Deze benadering maakt gebruik van het feit dat de zebravis mitfa gen werkt cellen autonoom. Daarom melanocyten gered door de miniCoopR vector zeker het minigen en elk gen van belang waaraan het fysiek gekoppeld bevatten. Gered melanocyten zijn duidelijk zichtbaar en kunnen worden verkregen in dieren die zijn geïnjecteerd als eencellige embryo. Een gespecificeerde mate van chimerisme is geselecteerd, en dieren over.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken dr. Leonard I. Zon in wiens laboratorium deze technieken werden in eerste instantie ontwikkeld, Kristen Kwan en de late Chi-Bin Chien voor geschenken van plasmiden gebruikt in dit werk, James Lister en David Raible voor hulp bij antilichaamkleuring, en James Neiswender voor het micro-injectie video. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie R00AR056899-03 naar CJC
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Gateway recombinatie reagentia | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference 5 | ||
| Mitfa antilichaam | Reference 5 | ||
| FITC geit anti-konijn IgG antilichaam | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper zebravis | Referentie 9 | ||
| 701N 10 pi Syringe | Hamilton / Fisher | 14 tot 824 | |
| 40 uM filter | BD Falcon / Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Referenties
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M.,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
