Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

Samenvatting

Een nieuw protocol voor de mechanische voorbehandeling van testiculaire celsuspensies van knaagdieren materiaal vermijden enzymen en wasmiddelen wordt beschreven. De methode is eenvoudig, snel, reproduceerbaar en maakt goede kwaliteit celsuspensies, die geschikt zijn voor flow sorteren en RNA-extractie zijn.

Samenvatting

Zoogdieren testes zijn zeer complexe organen die meer dan 30 verschillende soorten cellen, waaronder somatische testiculaire cellen en de verschillende stadia van germlinecellen bevatten. Deze heterogeniteit is een belangrijk nadeel met betrekking tot de studie van de grondslagen van zoogdieren spermatogenese, zoals zuivere of verrijkte celpopulaties in bepaalde stadia van spermaontwikkeling nodig voor twee moleculaire analyses ^1.

Verschillende strategieën zoals Staput ^2,3 centrifugale elutriatie ¹ en flowcytometrie (FC) ^4,5 zijn gebruikt om verrijkte of gezuiverde celpopulaties testicular verkrijgen om differentiële genexpressie studies mogelijk.

Het is vereist dat cellen in suspensie meeste verrijking / zuivering benaderingen. Idealiter zal de celsuspensie vertegenwoordiger van het oorspronkelijke weefsel, een hoog percentage levensvatbare cellen en enkele multinucleates - die meestal gevormd door desyncytieel aard van de seminifereus epitheel ^6,7 - en gebrek celklonten ^1. Eerdere rapporten had aangetoond dat testiculaire celsuspensies bereid door een uitsluitend mechanische methode samengeklonterd gemakkelijker dan getrypsiniseerde degenen ^1. Anderzijds, enzymatische behandelingen met RNAsen en / of disaggregeren enzymen zoals trypsine en collagenase leiden tot specifieke macromoleculen afbraak, hetgeen ongewenst is voor bepaalde verdere toepassingen. De ideale proces moet zo kort mogelijk zijn en op minimaal manipulatie, teneinde een goede bewaring van macromoleculen plaats zoals mRNA bereiken. Huidige protocollen voor de bereiding van celsuspensies van vaste weefsels gewoonlijk tijdrovend, sterk afhankelijk van de operator, en kunnen selectief beschadigen bepaalde celtypen ^1,8.

De hier gepresenteerde protocol combineert de voordelen van een zeer reproduceerbare en uiterst korte mechanische disaggregatie met eenbsence enzymatische behandeling, wat leidt tot goede kwaliteit celsuspensies die kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyse en sortering ⁴ en latere genexpressiestudies ^9.

Protocol

1. Bereiding van celsuspensies

1. Offeren het monster te gebruiken naar aanleiding van de aanbevelingen van de gespecialiseerde commissies, zoals IACUC of gelijkwaardig (in Uruguay, de Nationale Commissie voor Dierproeven [CNEA]). In ons geval werd een overdosis pentobarbital toegediend.
2. Ontleden de testes volgens standaard goedgekeurde procedures en plaats ze in een 96 mm glazen petrischaal op ijs, met 10 ml ijskoude DMEM aangevuld met 10% foetaal kalf serum.
3. Verwijder de tunicaalbuginea en snijd de gedecapsuleerde testes in vierkante stukjes van 2 - 3 mm aan elke kant.
4. Deze stukken worden vervolgens in een Medimachine, een geautomatiseerde mechanische maalinrichting waarbij het weefsel wordt opgesplitst in een wegwerpbare eenheid een geperforeerde roestvrij stalen scherm en een metalen rotor. Om dit te doen, plaats 1 ml koude aangevuld DMEM en 4-5 van deze stukken in een 50 um wegwerpeenheid, schakel de disaggregator en proces voor 50 sec na de eenvoudige instructies van de fabrikant.
5. Herstellen van de resulterende celsuspensie uit de opsplitsing apparaat met behulp van een 3 - 5 ml spuit zonder naald.
6. Filtreer door een 50 um nylon, eerder gedrenkt met 0,5 ml DMEM aangevuld.
7. Weer Filter de suspensie op met een doorweekte 25 pm nylon, en plaats op ijs.
8. Tellen in een Neubauer kamer en cellulaire concentratie aan te passen aan 1 - 2 x 10 ⁷ cellen / ml met DMEM aangevuld. Ten minste 4 x 10 ⁷ cellen / gram testis materiaal worden gewoonlijk verkregen.
9. Voeg tenslotte NDA (2-naftol-6 ,8-disulfonzuur, dikaliumzout) tot een uiteindelijke concentratie van 0,2% om cel klonteren te voorkomen.
10. Optioneel: check levensvatbaarheid van de cellen van de testis cel suspensies met een commercieel verkrijgbaar levensvatbaarheid kit voor dierlijke cellen, volgens de instructies van de fabrikant.

2. Flowcytometrische Analyse

ve_content "> We hebben een Becton-Dickinson FACSVantage flowcytometer met een Coherent argon ion laser afgestemd emitteren bij 488 nm voor de analyse van cellen gekleurd met hoge concentraties van propidiumjodide (PI) worden gebruikt. (De kwestie van PI entree in gefixeerde cellen onder stress is elders ^9,10 aangepakt).

1. Voor PI kleuring voeg fluorochroom bij een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml van de celsuspensie en incubeer gedurende 10 min bij 0 ° C in het donker.
2. Laservermogen is ingesteld op 100 mW en een 575/26 band pass filter wordt gebruikt om de PI-geëmitteerde fluorescentie te verzamelen in FL2.
3. We voeren FC metingen met een 70 um mondstuk. Voor het sorteren spermatocyt bevolking, ingesteld sorteren modus Normal-R of Normal-C, met 3 naargelang druppels als envelop. Houd monster en collectie buizen op 3 - 4 ° C met behulp van een koelunit. Pas monster differentiële om cellen te analyseren met een snelheid van 500 tot 1500 per seconde.
4. Gebruik CellQuest software (BD) te analyserende volgende parameters: voorwaartse verstrooiing (FSC-H), zijwaartse verstrooiing (SSC-H); totaal uitgezonden fluorescentie of pulse-gebied (FL2-A), en de duur van de fluorescentie-emissie of pulse-width (FL2-W).

Als alternatief hebben we de vitale kleurstof Hoechst 33342 toegepast om een ​​uiteindelijke concentratie van 5 ug / ml en gedurende 10 min bij 37 ° C in het donker. Cell analyse werd uitgevoerd door middel van een MoFlo cytometer (DakoCytomation) met een UV excitatie golflengte laser ingesteld op 25 mW en met een 70 um nozzle. Data manipulatie werd uitgevoerd met Summit v4.3 software (DakoCytomation).

Resultaten

Een voorbeeld van een goed opgesplitste celsuspensie van rattentestikels bereid met de hier beschreven protocol wordt getoond in figuur 1.

In vergelijking met enzymatische behandelingen ^6,8 en eerder beschreven mechanische uitsplitsing methoden ^2, de ene hier gepresenteerde is veel sneller, gaat minder handling, is gemakkelijk reproduceerbaar (niet afhankelijk van de operator), en maakt schaarse celbrokstukken (vooral in vergelijking met andere mechanis...

Discussie

De geoptimaliseerde hier beschreven methode maakt de bereiding van celsuspensies van knaagdieren testisweefsel in een zeer snelle en reproduceerbare wijze voorkomen enzym en detergensbehandeling en onderhouden goede celintegriteit en soort verhoudingen. De korte duur van de procedure (de 15 min overspanning omvat testis dissectie, weefsel snijdende en verwerking), minimaal hanteren van toepassing en geen enzymatische behandelingen zijn enkele van de belangrijkste voordelen. Al deze goed zijn voor de goede conservering v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Medimachine systeem	BD	340587
Medicon eenheid (50 μm)	BD	340591
Filcon eenheid (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetaal runder serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Voorraad oplossing 5 mg/ml; gebruikt bij een eindconcentratie van 5 μg/ml
Propidiumjodide	Sigma-Aldrich	287075	Voorraad oplossing 1 mg/ml; gebruikt bij een eindconcentratie van 50 μg/ml