We beschrijven een kwalitatieve test voor bacteriële concurrentie gemedieerd door de monitor Pseudomonas aeruginosa Type VI secretie systeem (T6SS). De assay is gebaseerd op de overleving / doden van Escherichia coli die een doelcellen LacZ-Reporter. Deze techniek is aan te passen aan de bactericide / bacteriostatisch activiteit van T6SS-bekwame micro-organismen te beoordelen.
Methodenartikel
Een Visual Assay om T6SS-gemedieerde Bacteriële Concurrentie Monitor
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Type VI secretiesystemen (T6SSs) zijn moleculaire nanomachines waardoor Gram-negatieve bacteriën te transporteren en eiwitten injecteren in een grote verscheidenheid van doelwitcellen 1,2. De T6SS bestaat uit 13 kerncomponenten en geeft structurele overeenkomsten met de staart-buis van bacteriofagen 3. De faag gebruikt een buis en een doorprikkend apparaat om de celenvelop van doelbacteriën dringen en injecteer DNA. Voorgesteld wordt de T6SS een omgekeerde bacteriofaag inrichting creëren van een bepaald pad in de bacteriële cel envelop effectors en toxinen rijden naar het oppervlak. Het proces kan worden voortgezet en de T6SS apparaat kan perforeren andere cellen waarmee de bacterie in contact, waardoor het injecteren van de effectoren in deze doelen. De staart buis en doorprikken onderdelen van het apparaat van de T6SS zijn gemaakt met Hcp en VgrG eiwitten, respectievelijk 4,5.
De veelzijdigheid van de T6SS is aangetoond door middel van studies met verschillende bacteriële pathogenen. De Vibrio cholerae T6SS kan remodelleren het cytoskelet van eukaryote gastheercellen door het injecteren van een "ontwikkelde" VgrG die een C-terminale actine verknoping domain 6,7. Een ander opvallend voorbeeld is recent gedocumenteerd met behulp van Pseudomonas aeruginosa, die in staat is om te richten en bacteriën te doden in een T6SS-afhankelijke manier, dus het bevorderen van de oprichting van bacteriën in specifieke microbiële niches en concurrentiële omgeving 8,9,10.
In het laatste geval zijn drie T6SS afgescheiden eiwitten, namelijk Tse1, Tse2 en tse3 geïdentificeerd als de toxinen geïnjecteerd in de beoogde bacteriën (Figuur 1). De donorcel wordt beschermd tegen de nadelige gevolgen van deze effectoren via een anti-toxine mechanisme gemedieerd door de Tsi1, Tsi2 en Tsi3 immuniteit eiwitten 8,9,10. Deze antimicrobiële activiteit kan worden gecontroleerd wanneer T6SS-bekwame bacteriën worden samen geteeld op sOlid oppervlakken in concurrentie met andere bacteriesoorten of met T6SS-inactieve bacteriën van dezelfde soort 8,11,12,13.
Uit de beschikbare gegevens benadrukt een numerieke benadering van de bacteriële concurrentie assay, met inbegrip van tijdrovende CFU tellen die sterk afhankelijk is van antibiotica makers. In het geval van antibiotica resistente stammen zoals P. aeruginosa, kan deze methoden niet geschikt zijn. Bovendien, met de identificatie van ongeveer 200 verschillende T6SS loci in meer dan 100 bacteriële genomen 14 een geschikte screening instrument is zeer wenselijk. Wij een assay die gemakkelijk te gebruiken en vereist standaard laboratorium materialen en reagentia. De methode biedt een snelle en goede techniek om de T6SS-afhankelijke bactericide / bacteriostasis activiteit te controleren met een reporter-stam als een prooi (in dit geval Escherichia coli DH5a) waardoor a-complementatie van de lacZ gen. Algemeen is deze methode graphic en maakt een snelle identificatie van T6SS-verwante fenotypes op agar platen. Dit experimentele protocol kan worden aangepast aan andere stammen of bacteriële species met inachtneming van specifieke aandoeningen zoals groeimedia, temperatuur of tijd van contact.
Protocol
1. Bacteriële stammen en culturen
- Ingenieur een Escherichia coli ontvangende cel (Prey, P) door de omvorming van (met behulp van standaard CaCl 2 behandeling of elektroporatie) 15 E. coli DH5a-cellen met een plasmide waarbij de a-complementatie van de lacZ gen (tabel 1). Plaat de getransformeerde cellen op Luria-Bertani agar platen (LBA, 1,5% agar) die 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) bij 40 mg / ml eindconcentratie en geschikte antibioticum. Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht en de volgende ochtend te kiezen voor blauw transformanten (zie § 1.3).
- Groeien de Pseudomonas aeruginosa donorcellen die T6SS-actieve (D +) of inactief T6SS-(D-) (tabel 1) op LBA nacht bij 37 ° C. In het voorbeeld dat hier we een P. aeruginosa RETS stam beziteen constitutief actieve H1-T6SS 16 en een isogene mutant met een deletie van de H1-T6SS gencluster (tabel 1).
- De volgende dag, voor te bereiden een overnachting vloeistof cultuur in beluchte fles door het enten van een heldere blauwe kloon van de E. coli transformanten (P) van de plaat beschreven in § 1.1, in 5 ml tryptische soja bouillon (TSB) aangevuld met de juiste antibiotica. Groeien onder roeren bij 37 ° C. Verder ook met een enkele kolonie van (D +) en (D -) van de plaat beschreven in § 1.2.
2. Competitiebepaling
- Bereid LBA platen voor de volgende dag experiment. Zorg ervoor dat deze platen goed gedroogd (ofwel in de buurt van de vlam, of in laminaire flow kast). Bereid een "test-input" (A-ingang) plaat voor de stammen (D +), (D -) en (P ). Bereid een "test-output" (A-output) plaat voor de stammen (D - + P) en (D + + P). Verdeel en dienovereenkomstig het etiket van de platen.
- Na een nacht kweken (zie § 1.3), meet de optische dichtheid (OD 600 nm) van de ingang bacteriecultuur (D -, D + en P) en bereken het volume vereist om een celdichtheid equivalent te komen met 1 eenheid OD 600nm van elke stam . Elke "input" celkweek (D -, D + en P) wordt in eerste instantie opgevangen in een steriele 1,5 ml Eppendorf buizen.
- Centrifugeer de bacteriële monsters bij 13.000 rpm gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellets van de D -, D + en P culturen in 100 pl vers TSB door zacht pipetteren en beënt 10 ml van elke overeenkomstigeovereenkomt stam als een vlek op de "A-ingang" plaat (opgesteld in § 2.1).
- Inoculeer de "A-output" plaat (opgesteld in § 2.1). Meer bepaald meng 30 pl (D +) met 30 pl (P) en 30 pi (D -) met 30 ml (P) in twee Eppendorf buizen (merk op dat de gebruikte culturen die beschreven in § 2.4) . Inoculeer 20 ul van de mengsels (D + / P) en (D - / P) als individuele vlekken op de "A-output" plate. Laat de spots buurt van een Bunsen brander drogen en de plaat in een incubator te plaatsen bij 37 ° C gedurende een passende periode gedurende welke de bacteriën doden plaatsvindt. Bij P. aeruginosa is een efficiënte bacteriële doden waargenomen na 5 uur incubatie bij vergelijking een T6SS actieve met T6SS defecte stam.
3. Kwalitatieve waarneming van thij Bacteriële Killing
- Bereid LBA platen die 40 ug / ml X-gal voor het uitlezen van de assay. De platen zullen worden genoemd "Uitlezen input" of "R-ingang" op geïsoleerde bacteriën of "Uitlezing uitgang" of "R-uitgang" op gemengde bacteriële culturen ontdekken en dus lees de doden prestaties te spotten. Deze platen moeten ook goed worden gedroogd. Verdeel de plaat in vier gelijke delen op zijn rug en annoteren deze delen 0, 10 -1, 10 -2 en 10 -3, de aanwijzing van de verdunningen van bacteriële cultuur te vinden in een agar platen (zie § 3.3). De verwatering zal een semi-kwantitatieve evaluatie van de blauw / witte bacteriën verhouding binnen dezelfde plek.
- Verzamel met een steriel oogje van de individuele bacteriële vlekken van de "A-ingang" plaat (zie § 2.4) en "A-output" plaat (zie § 2.5) en resuspendeer elke plek in afzonderlijke 1,5 ml Eppendorf buisjes met 1 ml TSB. Plaats in een Eppendorf shaker blok gedurende 30 minuten om efficiënt de resuspendeerbacteriën.
- Maak een reeks 5 keer drie Eppendorf buisjes die 900 ul TSB en ga elke spot geresuspendeerde tien voudige seriële verdunningen tot 10 -3. Zorg ervoor dat u pipetpunten te veranderen en vortex 5 seconden tussen elke verdunning stap.
- Overgaan tot het spotten van bacteriële verdunningen bereid in § 3.3 voor goed gedroogd LBA platen die 40 ug / ml X-gal door te beginnen met de verdunde het onverdunde suspensie, waardoor deze de "R-input" platen voor de "A -input "spots en de" R-output "platen voor de" A-output "spots (figuur 2). Vortex kort elke buis alvorens tot de spotting tot een homogeen bacteriële suspensie te houden. Voor reproduceerbaarheid van de resultaten, vlek 20 ul in drievoud binnen een kwadrant (Figuur 2). De relatieve droogheid van het bord is belangrijk in deze fase aangezien de spots moeten blijven individueel gescheiden op de plaat en niet glijden naar elkaar.
Een kwantificering van de competitiebepaling kan ook in dit stadium van het experiment. Na de stap 3,3, verspreid 100 ul van de verdunning 10 -3 op LBA-platen die 40 ug / ml X-gal. Voor reproduceerbaarheid van de resultaten, dan ook een plating in drievoud voor elke spot van de "A-output" plate. Plaats de verdunningsplaten in een 37 ° C incubator gedurende de nacht (of 16 uur incubatie). Ga verder naar de telling van de blauwe kolonies (de P cellen die nog in leven). Typische resultaten verkregen na 5 uur van concurrentie worden getoond in Figuur 3. - Laat de plaat open (zonder deksel) in een steriele zone om de absorptie van de vloeistof boven toe binnen elke spot.
- 'S nachts Plaats de plaat in een 37 ° C incubator. Tijdens deze incubatie tijd wordt de doding nog altijd plaats in de mix (D + / P) omdat beide stammen nog in contact.
- Maak een fotoof scan uw platen voor de output analyse (Figuur 2). Waar vlekken blijven grotendeels blauw geeft aan dat E. coli is niet gedood door P. aeruginosa. Dit is het geval wanneer E. coli wordt gemengd met een T6SS-defecte P. aeruginosa stam (D-) (Figuur 2, plaat aan de onderkant rechts).
Resultaten
Typische resultaten zijn weergegeven in figuur 1 met de stammen en reagentia beschreven in tabel 1. De platen getoond in deze figuur werden gescand na een nacht incubatie. De "uitlezing-Input" platen n seriële verdunning patroon voor de stammen die in deze assay. Zoals verwacht, de E. coli prooi spots (P) tot overexpressie het lacZ-gen weergegeven blauw op medium aangevuld met X-gal, terwijl de donor P. aeruginosa stammen (D +, T6SS actief) en (D -, T6SS inactief) blijven wit. De "Uitlezen-output" platen waarop de mix tussen de prooi en een T6SS actieve stam (D + / P) is gespot tonen het verdwijnen van de blauwe prooi dus aangeeft dat hij is vermoord. Dit toont het vermogen van de donor naar de prooi wegconcurreren. Het voortbestaan van de blauwe kleur op de (D - / P) plaat toont het onvermogen van een inactieve T6SS donor de blauwe prooi te doden.
Figuur 1. Doden van E. coli door T6SS-bekwame P. aeruginosa. P. aeruginosa injecteert gifstoffen in de E. coli doelcel in een T6SS-afhankelijke wijze (weergegeven door de witte pijl). Twee toxinen Tse1 en tse3 (oranje en rode cirkels) worden geïnjecteerd in de E. coli periplasma en degraderen de peptidoglycan 9. De Tse2 toxine (gele cirkel) ingespoten in de E. coli cytoplasma en een bacteriostatische werking 8,10. De gecombineerde actie van de giftige stoffen doodt de doelcellen (bliksemflits en schedel). De overleving van doelwitcellen kan worden gedetecteerd door het bewaken van de activiteit van de geproduceerde β-galactosidase (zie ook figuur 2). P. eeneruginosa is beschermd tegen de activiteit van de giftige stoffen door de immuniteit eiwitten Tsi1, Tsi2 en Tsi3 (oranje, geel en rode vierkantjes, respectievelijk) 8,9,10.
Figuur 2. Agarplaat test om T6SS-afhankelijke bacteriële doden controleren In deze figuur worden weergegeven op het bovenste deel van de "Uitlezen-Input" platen, bestaande uit de seriële verdunningen van de D -., D + en P-ingang cellen. De P ingang cellen blauw door de α-complementatie van de lacZ-gen en aldus geproduceerde β-galactosidase dat X-gal splitst. In het onderste deel wordt het "uitlezen-Output" platen bestaande uit seriële verdunningen van de bacteriële mix tussen een actieve (D + / P) , of een inactieve (D - / P), T6SS donor P. aeruginosa stam met E. coli prooi. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Kwantificering van het doden van E. coli door P. aeruginosa na 5 uur incubatie. De grafiek geeft de telling van E. CFU coli beschreven in stap 3.4. De resultaten hier laten een 3-voudig verschil tussen de T6SS + en T6SS-stammen, suggereert dat de meeste doden plaatsvindt tijdens de eerste 5 uur van contact.
Discussie
De methode die in dit artikel staat een visuele waarneming van T6SS-gemedieerde bactericide / bacteriostatisch activiteit. De test wordt uitgevoerd op het oppervlak van een agarplaat. Eerder is aangetoond dat T6SS afhankelijk doden assay uitgevoerd met gemengde bacteriële vloeibare cultuur niet efficiënt, waarschijnlijk door een gebrek aan constante contact tussen de twee bacteriën 8. De T6SS wordt verondersteld te werken met een mechanisme vergelijkbaar met degene die door bacteriofagen om DNA te injecteren in doelcellen 17. In vloeibare kweek, de buisvormige structuur van de T6SS kan gemakkelijker breken, kan inter-bacteriële contact verloren en de toxinen niet efficiënt leveren.
In termen van incubatietijden, de 5 eerste uren van contact dat we beschrijven tussen de donor stam en de prooi voldoende zijn om bacteriële doden tussen P. acht te nemen aeruginosa en E. coli, zoals geïllustreerd in figuur 3 . Niettemin is het raadzaam om de incubatietijd te passen door het uitvoeren van een kinetische om de experimentele omstandigheden te optimaliseren.
Aangezien deze methode een kleur gebaseerde techniek kan de uitgang resultaten worden beïnvloed door de pigmentatie van de donor stam. Bijvoorbeeld in het geval van P. aeruginosa, sommige stammen produceren hoge niveaus van gekleurde pigmenten zoals pyocyanin en pyoverdine, die kunnen interfereren met de bepaling uitlezing, zodat het verschil van de prooi relatief moeilijk. Andere chromogene substraten β-galactosidase, zoals de magenta-gal of rood-gal, worden gebruikt in plaats van de X-gal (tabel 1).
De competitiebepaling kan gebruik maken van andere reportergenen de uitlezing. Zo heeft overeenkomstige test ook uitgevoerd met groen fluorescent eiwit gemerkt prooien 12.
De assay, terwijl niet kwantitatieve geeft een goede indicatiede T6SS activiteit omdat het gebaseerd is op de overleving of het doden van een reporter prooi. Deze techniek heeft het voordeel dat het gemakkelijk en snel de bactericide / bacteriostasis activiteit van T6SSs evalueren van elke bacteriële species. Tot dusver is de activiteit van de T6SS is aangetoond tegen Gram-negatieve bacteriën en geen duidelijke voorbeeld van T6SS-gevoelige Gram-positieve bacteriën is gemeld nog 12. Het is ook duidelijk dat onverenigbaarheid in de cultuur van de verschillende bacteriesoorten te testen (bijv. groeitemperatuur, oxygenatie, specifieke media) moet worden beschouwd.
De test kan ook worden gebruikt om te evalueren welke T6SS componenten absoluut noodzakelijk omdat zelfs sporen van een uitgescheiden toxine kan volstaan om de prooi te doden. Zelfs zwakke activiteit van het T6SS kan dan duidelijk worden vastgesteld door ons assay vergeleken met standaard procedure testen T6SS-afhankelijke secretie met kweeksupernatant en western blotanalyse. Echter een goede kolonievormende eenheid (CFU) tellen blijft voor accurate kwantificering van deze T6SS activiteit.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust subsidie WT091939MA. Alain Filloux wordt ondersteund door de Royal Society.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van de Reagens / Materiaal | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| P. aeruginosa PAKΔ RETS (D +) (Actief T6SS) | Lab stam | Beschreven in referentie 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔ RETS Δ H1-T6SS (D -) (inactief T6SS) | Deze studie | De H1-T6SS cluster (omvat de genen te PA0070 PA0095) is verwijderd door allelische uitwisseling volgens de procedure beschreven in referentie 18. De mutator fragment werd gegenereerd met de volgende set van primers: The Up fragment primers: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 ', en 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 '. De Down fragment primers: 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 ', 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 ' | |
| E.coli DH5a | Invitrogen | 18258-012 | F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 eind A1 HSD R17 (r k -, m k +) pho Een sup E44 λ-thi -1 gyr A96 rel A1 |
| pBluescript II SK (+) | Agilent | 212205 | Deze vector brengt de α peptide van β-galactosidase voor α-complementatie. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Gebruik bij 40 ug / ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicaliën | 1.10283.0500 | |
| TSB (caseïne sojabonen bouillon) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrofotometer | WPA Biowave | CO8000 celdichtheid Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Onderzoek organische | 1364c | |
Tabel 1. Strain, plasmide, materiaal en reagens. |
Referenties
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570(2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355(2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508(2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234(2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25(2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343(2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613(2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876(2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057(2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources? BMC Genomics. 10, 104(2009).
- Maniatis, T., et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526(2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751(2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).
Herprints en machtigingen
