Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

Samenvatting

Een methode om de persistentielengte of buigstijfheid van biopolymeren meten beschreven. De methode gebruikt een kinesine aangedreven microtubule gliding assay experimenteel bepalen de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar aan actine gebaseerde assays glijden.

Samenvatting

Microtubules cytoskelet polymeren die een rol spelen in celdeling, mechanica en intracellulair transport. Elk van deze functies is microtubules die stijf en recht genoeg om een ​​aanzienlijk deel van de celdiameter overspannen. Daardoor is het microtubule persistentielengte, een maat van stijfheid, actief onderzocht voor de laatste twee decennia ^1. Niettemin, open vragen blijven: kort microtubuli zijn 10-50 keer minder stijf dan lange microtubuli ^2-4, en zelfs lang microtubuli hebben gemeten persistentie lengten die variëren van een orde van grootte ^5-9.

Hier presenteren we een methode om microtubule persistentie lengte te meten. De methode is gebaseerd op een kinesine aangedreven microtubule gliding assay ^10. Door het combineren van schaarse fluorescente labeling van individuele microtubuli met enkel deeltje volgen van individuele fluoroforen aan de microtubuli, de gliding trajecten van enkele microtubuli worden bijgehouden met nanometer-niveau precisie. De persistentielengte van de trajecten is hetzelfde als de persistentielengte van het microtubule onder de gebruikte ^11. Een geautomatiseerde volgen routine wordt gebruikt microtubule trajecten maken van fluoroforen aan individuele microtubuli, en de persistentielengte van dit traject wordt berekend op basis routines geschreven in IDL.

Deze techniek is snel uitvoerbaar en staat om de persistentielengte van 100 microtubuli in een dag experimenten. De werkwijze kan worden uitgebreid tot persistentielengte meten onder verschillende omstandigheden, waaronder persistentielengte als functie van lengte langs microtubuli. Bovendien kan de gebruikte analyse routines worden uitgebreid tot myosine-based assays werkende glijden, de persistentielengte van actine filamenten maatregel.

Inleiding

Het cytoskelet, een netwerk van biopolymeren in de meeste eukaryotische cellen een rol speelt in cellulaire organisatie, intracellulair transport en cel mechanica. De mechanische eigenschappen van de biopolymeren van het cytoskelet (voornamelijk actine en microtubuli) spelen een belangrijke rol bij het ​​bepalen van de mechanische eigenschappen van de cel als geheel ^12. Sinds hele cel mechanica kunnen karakteriseren gezonde en zieke cellen ^13,14 en is betrokken bij cellulaire motiliteit ^15, zijn de mechanische eigenschappen van de onderliggende cytoskelet componenten al een actief gebied van onderzoek voor de afgelopen twee decennia ^1.

De flexibiliteit (of stijfheid) van biopolymeren wordt gekenmerkt door de persistentielengte de lengte polymeer dat bochten met ongeveer een radiaal onder thermische fluctuaties bij omgevingstemperatuur. Een aantal technieken zijn ontwikkeld om persistentielengte ^16, voor meten voorble actieve technieken die erin buigen het polymeer met hydrodynamische stroming, optische vallen of elektrische velden ^4,17,18 en passieve technieken die fluctuaties van vrije polymeren in oplossing ^5,6 meten. De actieve metingen vereisen echter speciale opstellingen om bekende krachten te passen op de micrometer schaal, en de free-fluctuatie metingen kan een uitdaging zijn als gevolg van diffusie uit het vlak van de focus van de gebruikte microscoop.

In dit artikel beschrijven we een complementaire, passief, techniek om de persistentie lengte van microtubuli, een cytoskelet polymeer te meten. De techniek bestaat glijden assays die ervoor zorgen dat het polymeer altijd in het brandvlak ^19. Bovendien gaat volgen enkele fluoroforen permanent aan het polymeer van belang, zodat specifieke locaties langs de polymeerketen goed gekarakteriseerd.

Een cartoon van de methode wordt in Figure 1. Kinesine beweegt specifiek in de richting + einde van de microtubuli, dus de microtubuli in een glijdende assay zijn unidirectioneel aangedreven. Het voorste einde van de microtubuli, voorbij de laatste bevestigd kinesine, vrij fluctueren onder de thermische krachten van de omringende oplossing. Omdat de microtubule naar voren gestuwd, het einde fluctueert tot binding aan een nieuwe kinesine molecule verder langs het glaasje bevriest in een bepaalde fluctuatie. Omdat kinesine hecht zeer sterk microtubules wordt de microtubule beperkt tot het pad van het leidende einde volgen. Derhalve zullen de fluctuaties in de bevroren microtubule traject zijn dezelfde als de statistische fluctuaties van het vrije uiteinde van microtubuli ¹¹ en kan dus worden gebruikt om de persistentielengte berekenen volgens conclusie ²⁰

waarbij l _p de persistentielengte van het microtubule, θ de hoek _is tussen raaklijnen aan de baan gescheiden door een contour lengte s en <> duidt een gemiddelde van alle paren posities gescheiden door een contour lengte s.

De glijdende test zelf maakt gebruik van kinesine gebiotinyleerd aan het opgerolde spoel ²¹ specifiek gebonden aan het glasplaatje via een streptavidine-biotine koppeling. Deze bevestiging zorgt ervoor dat de motor vrij domeinen bindt aan microtubuli stuwen. Met het oog op microtubuli trajecten volgen, zijn microtubuli dun gelabeld met organische fluoroforen ^22,23 - de etiketten moeten worden schaars genoeg dat enkele fluoroforen zijn oplosbaar met behulp van single molecule fluorescentie microscopie. Single fluoroforen worden bijgehouden met behulp van beeldanalyse routines geschreven in IDL. De banen van elk fluorofoor gebonden aan een bepaalde microtubule gecombineerd tot een samengesteld microtubule traject automatisch ^24. De raaklijn hoeken θ elk punt langs een traject berekend en uit deze raaklijn loodrecht op s> waarde berekend voor elke contour lengte s. Tot slot worden deze gegevens aanpassen aan Eq. 1 om een ​​persistentielengte extraheren voor een bepaalde microtubule of vele microtubuli in dezelfde assay glijden.

De werkwijze is robuust genoeg om bij microtubuli bereid in een grote verscheidenheid van aandoeningen (met verschillende stabilisatoren of andere kleine moleculen gebonden aan de microtubuli, met gebonden microtubule-geassocieerde eiwitten (MAP's), of met verschillende viskeuze oplossingen). In ons laboratorium werd de techniek gebruikt om de persistentielengte van microtubuli karakteriseren als functie van lengte langs de microtubuli en microtubules met verschillende stabilisatoren. De belangrijkste beperking is dat de microtubuli moet nog sTEUN kinesine motiliteit. Omdat kinesine is een robuuste motor enzym, dit is een vrij losse beperking. Door het vervangen van microtubuli met actine en myosine kinesine een familie enzym kan de persistentielengte van actine wordt gemeten met dezelfde techniek.

Protocol

1. Microtubuli Zweefvliegen Assay Stock Solutions

Bereid voor op zweefvliegen test.

1. Polymeriseren 0,5 mg microtubuli dun gelabeld met heldere organische fluorofoor ^22. Het doel etiket concentratie is 1 fluorofoor per micrometer van microtubuli, of een etikettering dichtheid van ongeveer 1 fluorofoor per 1.500 tubuline-dimeren. Bewaren bij kamertemperatuur, licht beschermd met aluminium, folie voor maximaal twee weken.
2. Zuiveren biotine-kinesine ²¹ ongeveer 1 uM. Bij -80 ° C in 5 pi aliquots voor gebruik in afzonderlijke experimenten.
3. Bereid de assay buffer (AB) van 50 mM imidiazole, 50 mM kaliumchloride (KCl), 4 mM magnesiumchloride _(MgCl2), 2 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), pH 6,7. Steriel filter en bewaar bij 4 ° C.
4. Los gebiotinyleerde bovine serum albumine (BSA-biotine) tot 2 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter.Bij -80 ° C in 100 ul aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
5. Los streptavidine (SA) tot 10 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 20 pi aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende twee weken.
6. Los α-caseïne tot 5 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 100 ul aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende twee weken.
7. Los dithiothreitol (DTT) in gedeïoniseerd water bij 200 mM. Bij -20 ° C in 100 ul aliquots binnen 8 uur na ontdooien. Kan opnieuw worden ingevroren.
8. Los paclitaxel (PT) in HPLC-grade dimethylsulfoxide (DMSO) bij 4 mM. Bewaren in 10 ul aliquots bij -80 ° C op lange termijn, -20 ° C op korte termijn. Gebruik binnen 8 uur na ontdooien. Kan opnieuw worden ingevroren.
9. Los glucose in gedeïoniseerd water bij 120 mg / ml. Store in 100 ul aliquots bij -20 ° C. Kan opnieuw worden ingevroren.
10. Dislossen adenosine trifosfaat (ATP) in gedeïoniseerd water bij 150 mM, pH 7,0. Store in 5 pi aliquots bij -80 ° C binnen 8 uur na ontdooien.
11. Bereid 100x zuurstofwegvangende voorraad ²⁵ door het oplossen van 10.000 eenheden glucose-oxidase en katalase 156.000 eenheden in 600 ul totaal assay buffer. Centrifugeer kort in een microcentrifuge om pellet vaste stoffen; filter supernatant met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 10 pi aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende maximaal een week.

2. Microtubuli Zweefvliegen Assay, Same Day Solution Voorbereiding

Bereid de oplossingen 2,1-2,6 op de dag van het experiment. Met wat oefening kun oplossingen 2,2-2,6 worden voorbereid tijdens de flow-cel wassen. Tenzij anders vermeld, houden voorraad oplossingen op ijs.

1. Bereid AB, 1 ml assaybuffer met 10 ul DTT stock (AB met 2 mM DTT). Bewaren bij kamertemperatuur.
2. Bereid bio-BSA buffer, 40 & mu, L van een 1:1 mengsel van de biotine-BSA stock en AB. Bewaren bij kamertemperatuur.
3. Bereid BSA buffer, 645 pl mengen AB met 5,5 ul BSA (1 mg / ml BSA in AB). Bewaren bij kamertemperatuur.
4. Bereid SA buffer, mengen 57 pl AB met 3 ui streptavidine stock (0,5 mg / ml streptavidine in AB). Bewaren bij kamertemperatuur.
5. Bereid α-caseïne buffer, mengen 200 ul BSA buffer, 50 pl stock caseïne en 0,8 pi 15 uM ATP (1 mg / ml α-caseïne, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Bewaren bij kamertemperatuur.
6. Bereid fluorescentie anti-bleach buffer, 95 pi mengen α-caseïne buffer, 2,5 pl stock glucose, 1 pi 100x zuurstofvanglaag mix, 1 ul paclitaxel stock, 1 pi 2-mercaptoethanol (βME). Voeg βME onder zuurkast. Gebruik fluorescentie anti-bleach buffer binnen 1 uur van voorbereiding. LET OP: βME is zeer giftig en ruikt verschrikkelijk. Zorg ervoor dat u alleen open onder de zuurkast. Bewaar fles in deafwezigheid van licht, licht degradeert βME en zijn vermogen om fotobleken te verminderen.

3. Microtubuli Gliding Assay

1. Construct ongeveer vier stromen banen tussen een 24 x 60 mm dekglaasje en 22 x 22 mm dekglaasje onder vacuüm vet, uit een spuit geëxtrudeerd door een pipetpunt, een spacer. Elke stroom rijstrook moet ongeveer 10 ul in volume (schaal volgende delen daarvan) zijn.
2. Wassen 10 ul van bio-BSA buffer in elke baan. Incubeer 5 min te laten BSA de vacht van de glazen oppervlakken.
3. Was elke baan drie keer met 15 ul BSA-buffer te verwijderen vrij biotine-BSA, terwijl u de schuif oppervlak te blokkeren. Gebruik een Kimwipe of filtreerpapier om buffer te verwijderen uit tegenovergestelde kant van stroom-kamer, en zorg ervoor dat niet toe te staan ​​luchtbellen om te gaan door de stroom kamer.
4. Was de 15 ul SA-buffer in elke baan. Wacht 10 minuten, of tot 2 uur. De streptavidine binden aan het oppervlak gebonden biotine-BSA.
5. Was elke baan drie keer met 15 ul BSA-buffer om gratis SA te verwijderen terwijl u de schuif oppervlak te blokkeren.
6. Was elke baan met 15 ul α-caseïne buffer. α-caseïne helpt verder niet-specifieke binding van kinesine en microtubuli blokkeren het glas.
7. Verdun kinesine tot 10 nM in α-caseïne buffer en was elke baan met 15 ul van deze kinesine - α-caseïne-oplossing. Wacht 15 min (of tot een uur) voor de gebiotinyleerde kinesine specifiek binden aan het oppervlak gebonden streptavidine. De kinesine motorische domeinen blijft vrij om te binden microtubuli.
8. Verdun paclitaxel tot 40 uM in de kamer-temperatuur α-caseïne buffer, en was elke baan met 15 ul van deze oplossing uit te spoelen vrij kinesine en Aan een aanvoer kamer vooraf te laden met een paclitaxel-oplossing aan microtubuli voorkomen depolymeriseren. Koud ook microtubuli depolymeriseert, dus zorgen dat deze stappen uitgevoerd te maken bij kamertemperatuur met ruimte temperare oplossingen.
9. Verdunde fluorescent gelabelde microtubuli 1:100-1:1,000 in fluorescentie anti-bleach-buffer met 1 mM ATP. Was de 15 ul in een rijstrook en neem binnen 30 minuten.

4. Data Collection

1. Let op de microtubuli zweefvliegen met behulp van fluorescentie microscopie, een microscoop kan oplossen enkele fluoroforen zoals een commerciële of home-build TIRF installatie vereist ²⁶ (figuur 2).
   De microtubules worden aangedreven door de motoren kinesine op het substraat ongeveer 0,5 um / s, afhankelijk van de temperatuur. Als het veld-of-view van de microscoop is 50 urn moeten individuele microtubuli zichtbaar voor ongeveer 100 sec. Stel lichtintensiteit zodat enkele fluoroforen niet photobleach sneller dan 100 sec. Bij gebruik laserexcitatie een vermogensinstelling van ongeveer 3-5 mW geschikt.
2. Verzamel sequenties van beelden voor analyse. 600 beelden op5 Hz (2 min totaal) werkt goed. Gebruik sequenties lang genoeg dat microtubuli het gehele veld-of-view doorkruisen.

5. Data-analyse

Een IDL routine, get_lp.pro , is bevestigd. Deze routine geeft een persistentielengte waarde op basis van alle microtubuli zweefvliegen in een bepaalde sequentie van beelden. Ofwel het uitvoeren van deze routine op elk beeld reeks, wijzigen intensiteit parameters afhankelijk van uw specifieke microscoop setup, of doe het volgende:

1. Houd elke fluorofoor bevestigd aan een microtubule om fluorofoor trajecten te creëren.
2. Combineren alle trajecten van fluoroforen op een bepaalde microtubule in een algemeen microtubule traject; herhalen voor elk microtubule in de reeks beelden (figuur 3).
3. Bereken de tangens hoek elk punt langs de baan (figuur 4)En berekenen θ _s> in Eq. Een door het gemiddelde cosinus van de hoek verschil voor elk paar punten gescheiden door een weglengte s (Figuur 5). Vind de persistentie lengte voor een enkele microtubule of een groep van microtubuli door het aanbrengen van θ _s> aan Eq. 1, weging van de afzonderlijke gegevenspunten in de pasvorm van het aantal onafhankelijke waarden van cos θ _s die worden gebruikt om het gemiddelde te berekenen.

Resultaten

Een momentopname van een glijdende assay is weergegeven in figuur 2. Een goede microtubuli dichtheid is 1 tot 10 microtubuli per gezichtsveld; aanzienlijk meer zal resulteren in Haperingen als microtubuli elkaar kruisen. Een grafiek van de 11 microtubule trajecten van de glijdende assay in figuur 2 is weergegeven in figuur 3. Typische trajecten zijn 10 tot 30 micrometer lang, sommige trajecten hebben gaten waar een microtubule kruist elkaar. Deze trajecten kunnen worden...

Discussie

Persistentielengte metingen een goede karakterisering van de mechanische eigenschappen van individuele biopolymeren. In dit artikel hebben we een methode beschreven voor het meten van de persistentielengte van microtubuli. Zoals vermeld in de inleiding, is deze werkwijze gemakkelijk uitgebreid onderzoek microtubule mechanische eigenschappen in verschillende omstandigheden eenvoudigweg door het variëren van de reagentia, temperatuur of viscositeit in de laatste stap van de assay glijden, 3.9, of door polymerisatie van mi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesiumchloride	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Gebiotinyleerd BSA	Thermo Scientific	29130
Α-caseïne	Sigma-Aldrich	C6780
Streptavidine	Thermo Scientific	21125
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C100
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Koop klein bedrag.
24X60 mm No 1 1/2 afdekglas	VWR	48393-252
22x22 mm nr. 1 afdekglas	Gold Seal	3306
High Vacuum Grease	Dow-Corning	NA
Apparatuur
TIRF microscoop	Veel	NA	De TIRF microscoop gebruikt in deze methode was zelfgemaakt.
IDL (software)	Exelis	NA	Kan vervangen MATLAB, ImageJ, of andere software voor beeldanalyse.