Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

Samenvatting

Een methode om de persistentielengte of buigstijfheid van biopolymeren meten beschreven. De methode gebruikt een kinesine aangedreven microtubule gliding assay experimenteel bepalen de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar aan actine gebaseerde assays glijden.

Samenvatting

Microtubules cytoskelet polymeren die een rol spelen in celdeling, mechanica en intracellulair transport. Elk van deze functies is microtubules die stijf en recht genoeg om een ​​aanzienlijk deel van de celdiameter overspannen. Daardoor is het microtubule persistentielengte, een maat van stijfheid, actief onderzocht voor de laatste twee decennia ^1. Niettemin, open vragen blijven: kort microtubuli zijn 10-50 keer minder stijf dan lange microtubuli ^2-4, en zelfs lang microtubuli hebben gemeten persistentie lengten die variëren van een orde van grootte ^5-9.

Hier presenteren we een methode om microtubule persistentie lengte te meten. De methode is gebaseerd op een kinesine aangedreven microtubule gliding assay ^10. Door het combineren van schaarse fluorescente labeling van individuele microtubuli met enkel deeltje volgen van individuele fluoroforen aan de microtubuli, de gliding trajecten van enkele microtubuli worden bijgehouden met nanometer-niveau precisie. De persistentielengte van de trajecten is hetzelfde als de persistentielengte van het microtubule onder de gebruikte ^11. Een geautomatiseerde volgen routine wordt gebruikt microtubule trajecten maken van fluoroforen aan individuele microtubuli, en de persistentielengte van dit traject wordt berekend op basis routines geschreven in IDL.

Deze techniek is snel uitvoerbaar en staat om de persistentielengte van 100 microtubuli in een dag experimenten. De werkwijze kan worden uitgebreid tot persistentielengte meten onder verschillende omstandigheden, waaronder persistentielengte als functie van lengte langs microtubuli. Bovendien kan de gebruikte analyse routines worden uitgebreid tot myosine-based assays werkende glijden, de persistentielengte van actine filamenten maatregel.

Inleiding

Het cytoskelet, een netwerk van biopolymeren in de meeste eukaryotische cellen een rol speelt in cellulaire organisatie, intracellulair transport en cel mechanica. De mechanische eigenschappen van de biopolymeren van het cytoskelet (voornamelijk actine en microtubuli) spelen een belangrijke rol bij het ​​bepalen van de mechanische eigenschappen van de cel als geheel ^12. Sinds hele cel mechanica kunnen karakteriseren gezonde en zieke cellen ^13,14 en is betrokken bij cellulaire motiliteit ^15, zijn de mechanische eigenschappen van de onderliggende cytoskelet componenten al een actief gebied van onderzoek voor de afgelopen twee decennia <....

Protocol

1. Microtubuli Zweefvliegen Assay Stock Solutions

Bereid voor op zweefvliegen test.

1. Polymeriseren 0,5 mg microtubuli dun gelabeld met heldere organische fluorofoor ^22. Het doel etiket concentratie is 1 fluorofoor per micrometer van microtubuli, of een etikettering dichtheid van ongeveer 1 fluorofoor per 1.500 tubuline-dimeren. Bewaren bij kamertemperatuur, licht beschermd met aluminium, folie voor maximaal twee weken.
2. Zuiveren biotine-kinesine ²¹ ongeveer 1 uM. Bij -80 ° C in 5 pi aliquots voor gebruik in afzonderlijke experimenten.
3. Bereid de assay buffer (AB) van 50 mM imidiazole, 50 m....

Resultaten

Een momentopname van een glijdende assay is weergegeven in figuur 2. Een goede microtubuli dichtheid is 1 tot 10 microtubuli per gezichtsveld; aanzienlijk meer zal resulteren in Haperingen als microtubuli elkaar kruisen. Een grafiek van de 11 microtubule trajecten van de glijdende assay in figuur 2 is weergegeven in figuur 3. Typische trajecten zijn 10 tot 30 micrometer lang, sommige trajecten hebben gaten waar een microtubule kruist elkaar. Deze trajecten kunnen worden.......

Discussie

Persistentielengte metingen een goede karakterisering van de mechanische eigenschappen van individuele biopolymeren. In dit artikel hebben we een methode beschreven voor het meten van de persistentielengte van microtubuli. Zoals vermeld in de inleiding, is deze werkwijze gemakkelijk uitgebreid onderzoek microtubule mechanische eigenschappen in verschillende omstandigheden eenvoudigweg door het variëren van de reagentia, temperatuur of viscositeit in de laatste stap van de assay glijden, 3.9, of door polymerisatie van mi.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesiumchloride	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Gebiotinyleerd BSA	Thermo Scientific	29130
Α-caseïne	Sigma-Aldrich	C6780
Streptavidine	Thermo Scientific	21125
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C100
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Koop klein bedrag.
24X60 mm No 1 1/2 afdekglas	VWR	48393-252
22x22 mm nr. 1 afdekglas	Gold Seal	3306
High Vacuum Grease	Dow-Corning	NA
Apparatuur
TIRF microscoop	Veel	NA	De TIRF microscoop gebruikt in deze methode was zelfgemaakt.
IDL (software)	Exelis	NA	Kan vervangen MATLAB, ImageJ, of andere software voor beeldanalyse.